VEGF165b和VEGF165在胃癌組織中的表達及與預后的關系*

關云艷，諸靜芬，歐希龍，吳海榮，吳錫平，王倩

（1.江蘇省無錫市中醫醫院消化內科，江蘇 無錫 214071；2.東南大學醫學院附屬中大醫院，消化內科，江蘇 南京 210009）

·臨床論著·

VEGF165b和VEGF165在胃癌組織中的表達及與預后的關系*

關云艷1，諸靜芬1，歐希龍2，吳海榮1，吳錫平1，王倩1

（1.江蘇省無錫市中醫醫院消化內科，江蘇 無錫 214071；2.東南大學醫學院附屬中大醫院，消化內科，江蘇 南京 210009）

目的研究VEGF165b和VEGF165在胃癌及癌旁正常組織中的表達及胃癌組織中VEGF165b mRNA/VEGF165 mRNA與預后的關系。方法分別應用實時RT-PCR和免疫組織化學法檢測胃癌及癌旁正常組織中VEGF165b和VEGF165的基因及蛋白表達，并對患者進行2年的隨訪，比較VEGF165b mRNA/ VEGF165 mRNA比值及這兩種蛋白表達水平在胃癌及癌旁組織中的變化；同時分析VEGF165b與VEGF165蛋白表達的相關性以及胃癌組織中VEGF165b mRNA/VEGF165 mRNA與預后的關系。結果在胃癌組織中VEGF165b mRNA/VEGF165 mRNA低于癌旁正常組織中的水平；在癌旁正常組織中VEGF165b基因及蛋白表達強于VEGF165，在胃癌組織中VEGF165b基因及蛋白的表達則低于VEGF165，而且兩者表達呈負相關關系；此外，在兩年內死亡的患者中VEGF165b mRNA/VEGF165 mRNA明顯低于生存患者中的比值水平。結論與正常組織相比，胃癌組織中存在VEGF165b向VEGF165基因及蛋白水平上的優勢轉換，這種變化有望成為治療胃癌的新靶點。

VEGF165b；VEGF165；實時RT-PCR；免疫組織化學；胃癌

目前已知腫瘤的生長和轉移依賴于血管的形成，而這一過程主要是由于促血管生成因子和抑制因子調控失衡，促血管生成因子增多所致。其中作用最強的就是血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），但近年來研究結果顯示并不是所有的VEGF變構體都有此作用，其新型剪接變構體-VEGFxxxb則具有抑制血管形成的作用。由于VEGF165在VEGF-A中所占比例最高，且生物活性最強，故在臨床和實驗中應用最廣，相應地VEGF165b也就受到頗多關注。為此，該研究應用實時RT-PCR、免疫組織化學方法分別檢測胃癌及癌旁正常組織中VEGF165b、VEGF165基因及蛋白的表達情況的變化；并分析這兩種蛋白表達的相關性以及VEGF165b mRNA/VEGF165 mRNA與預后之間的關系。

1 資料與方法

1.1材料與試劑

選取東南大學附屬中大醫院2009年9月-2010年9月進行手術的胃癌患者48例。所有患者均有完整的臨床及病理資料，術前均未行化療或其他針對腫瘤的治療，癌旁正常組織是取距離癌組織5 cm以上的外觀正常的組織。其中男34例，女14例；年齡25～79歲，平均（59.08±11.63）歲。病變直徑≥5 cm者28例，＜5 cm者20例。根據TNM臨床分期標準，Ⅰ期4例，Ⅱ期16例，Ⅲ期26例，Ⅳ期2例。有淋巴結轉移的35例，無轉移的13例；侵犯血管形成癌栓者29例，未侵犯血管者19例；病理類型顯示腺癌分別為35例，腺鱗癌2例，鱗癌3例，印戒細胞癌8例。

熒光定量PCR試劑盒（SYBRGreen）購于TaKaRa公司，引物由南京凱基生物公司合成，VEGF165、 VEGF165b一抗均購自英國abcam公司，免疫組織化學試劑盒購自福州邁新生物工程技術公司。

1.2實驗方法

1.2.1實時RT-PCR方法檢測胃癌及癌旁正常組織中VEGF165b mRNA、VEGF165 mRNA的表達以Trizol提取標本中總RNA，取RNA樣品用1×TE Buffer稀釋樣品100倍，測定樣品在260nm和280 nm的吸收值確定RNA的質量。按以下計算RNA的濃度=A260×稀釋倍數×0.04μg/μl，A260/280在1.8～2.1視為抽提的RNA的純度很高。然后逆轉錄合成cDNA，接著進行熒光定量PCR，以cDNA為模板，表1顯示序列為引物，反應體系（20μl）：2×Realltime PCR Master Mix（SYBRGreen）10μl+模板（cDNA稀釋10倍）1μl+引物MIX（F/R各為10μmol）2μl+DEPC 7μl。反應條件：95℃5 min，95℃15 s，63℃30 s，72℃30 s，40個循環。

1.2.2免疫組織化學方法檢測胃癌組織及癌旁正常組織中VEGF165b、VEGF165蛋白的表達所有標本經10%甲醛固定，石蠟包埋，制成4μmol的連續切片，采用免疫組織化學SP法檢測胃癌手術標本的腫瘤組織和癌旁正常組織中VEGF165和VEGF165b的表達。應用微波爐恒溫抗原修復后滴加相應一抗（1∶100），孵育過夜后滴加二抗（1∶500）及DAB顯色，以磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗作陰性對照組，已知結腸癌陽性片作陽性對照組。以細胞結構中存在粗細一致的棕黃色顆粒為陽性，其中VEGF165b和VEGF165陽性顆粒均分布于細胞胞漿。雙盲法隨機觀察5個不同高倍視野，各計數500個細胞，判斷標準如下：根據染色的細胞數量及染色強度分為陰性（-），無陽性細胞染色或陽性細胞數＜10%；弱陽性（+），陽性細胞在10%～25%之間；中度陽性（++），陽性細胞25%～75%；強陽性

（+++）,陽性細胞＞75%。

1.3統計學方法

采用SAS 8.0統計軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（±s）表示，組間兩兩比較用t檢驗，計數資料進行χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1胃癌及癌旁正常組織中VEGF165b mRNA、VEGF165 mRNA的表達

胃癌組織中VEGF165 mRNA的相對表達量（5.363±2.499）高于癌旁正常組織（1.899±0.759），兩組比較差異有統計學意義（P＜0.01）。VEGF165b mRNA在胃癌組織中表達的相對量是（1.549± 0.5819），低于在癌旁正常組織表達的相對量（2.960±1.043），差異有統計學意義（P＜0.01）。而且VEGF165b mRNA/VEGF165 mRNA這一比值在癌旁正常組織中高于胃癌組織（P＜0.01）。見圖1。

圖1 VEGF165b mRNA and VEGF165 mRNA在胃癌及癌旁正常組織中的差異性表達

2.2VEGF165b和VEGF165蛋白在胃癌及癌旁組織中的表達

在胃癌組織中VEGF165b和VEGF165表達的陽性率分別為27.08%和64.58%，在癌旁正常組織中VEGF165b和VEGF165表達的陽性率分別為75.00%和39.58%。VEGF165b和VEGF165在胃癌及癌旁組織中表達程度不同，差異有統計學意義。在胃癌組織中VEGF165b表達低于VEGF165（見圖2B和圖3B），而在癌旁正常組織中VEGF165b表達則強于VEGF165（見圖2A和圖3A）。

圖2 VEGF165b的表達

圖3 VEGF165的表達

2.3VEGF165b和VEGF165蛋白表達的相關性

胃癌及癌旁組織標本共96例，兩者間表達呈負相關性（P=0.0064，Pearson系數=0.3808）。見表2。

表2 VEGF165和VEGF165b表達的相關關系

2.4胃癌組織中VEGF165b mRNA/VEGF165 mRNA的比值與預后的關系

在兩年的隨訪中，有3例失訪，45例中有16例死亡。兩年死亡率35.6%。胃癌組織中VEGF165b mRNA/VEGF165 mRNA在生存組中為（0.415± 0.271），死亡組中為（0.26±0.135），兩組比較差異有統計學意義（t=2.53，P=0.016）。

3 討論

在腫瘤的生長過程中VEGF165起著至關重要的作用，促進腫瘤生長的機制除促進血管形成以外，對某些體外培養的腫瘤細胞也有直接的促增殖作用[1-2]，并能增加腫瘤對化學藥物的抗藥性[3]。2002年BATES等[4]分離出血管內皮生長因子VEGF-A的新型剪接變構體－VEGF165b，選擇性剪接發生于外顯子8的遠端，在結構上與VEGF165相比，僅表現為終末6個氨基酸的不同，VEGF165b與VEGFR-2的

親和力等同于VEGF165，但僅能微弱而短暫地激活VEGFR2及其下游信號分子，從而競爭性地抑制VEGF165生物學作用的發揮，起到抑制VEGF165所誘導的內皮細胞增殖、遷移及血管舒張、血管生成的作用。隨后研究人員也證實VEGF xxxb這一抑制性剪接變構體家族的存在。VEGF165b多存在于正常細胞、組織及血液循環中，尤其在具有高水壓傳導性的組織如脈絡叢以及腎小囊足細胞表達較高[5]，在腎細胞癌、前列腺癌中表達均下調。后來PRITCHARD-JONES等[6]研究顯示，在正常表皮和一部分惡性黑色素瘤的標本中有VEGF165b的表達，但在腫瘤標本中表達微弱；而且與未發生轉移的腫瘤相比，在隨后發生轉移的腫瘤組織中VEGF165b表達明顯減少，而周圍正常組織的VEGF165b表達沒有變化。RENNEL[7]用裸鼠構建結腸癌模型，隨后以重組VEGF165b蛋白腹腔內注射，結果顯示VEGF165b重組蛋白抑制腫瘤的生長。

目前，為止發現在腎細胞癌[4]、前列腺癌[4]、惡性黑色素瘤[6]、食管癌[8]、結直腸癌[9]中表達均下調，但在膀胱癌中表達情況尚有爭議，DAS等[10]研究顯示在膀胱移行細胞癌中VEGF165b表達上調，也有VEGF165b在膀胱移行細胞癌中表達下調的報道[11]。目前，這方面研究僅限于上述腫瘤，尚無VEGF165b在胃癌中表達情況的研究，而筆者通過應用實時RT-PCR及免疫組織化學方法證實VEGF165b基因及蛋白在癌旁正常組織中表達高，在胃癌組織中表達降低，VEGF165的表達情況正好相反；此外，胃癌組織中VEGF165b mRNA/VEGF165 mRNA低于癌旁正常組織中的比值，這一比值下降程度越明顯，預后就越差，而且這兩種蛋白表達程度呈負相關性。由此認為，在胃癌組織中也存在VEGF165b向VEGF165的剪接優勢轉換，因此控制這種剪接轉換或補充外源性VEGF165b有望成為治療胃癌的關鍵。NOWAK等[12]研究一些細胞內剪接因子及細胞外生長因子對該選擇性剪接的影響，結果顯示SRp55、TGF-β1可上調VEGF165b基因及蛋白的表達，抑制p38 MAPK途徑則降低后者所誘導的遠端選擇性剪接的發生。CIURA等[13]報道丁酸鹽可以上調人肺微血管內皮細胞VEGFxxxb基因的表達水平，同時也伴隨著相應蛋白的增加。以上結果還僅限于體外實驗，如果能在體內控制VEGF mRNA的剪接模式，將會有重要的臨床應用價值，這也是以后的研究方向。

[1]TIANX,SONG S,WU J,et al.Vascular endothelial growth factor:acting as an autocrine growth factor for human gastric adenocarcinoma cell MGC803[J].Biochem Biophys Res Commun, 2001,286(3):505-512.

[2]ZHANG H,WU J,MENG L,et al.Expression of vascular endothelial growth factor and its receptors KDR and Flt-1 in gastric cancer cells[J].World J Gastroenterol,2002,8(6):994-998.

[3]ZHANG XS,ZHU XF,GAO JS,et al.Multiple drug resistance phenotype of human endothelial cells induced by vascular endothelial growth factor 165[J].Acta Pharmacol Sin,2001,22(8): 731-735.

[4]BATES DO,CUI TG,DOHERTY JM,et al.VEGF165b,an ihibitory splice variant of vascular endothelial growth factor,is down-regulated in renal cell carcinoma[J].Cancer Res,2002,62 (14):4123-4131.

[5]BEVAN HS,VAN DEN AKKER NM,QIU Y,et al.The alternatively spliced anti-angiogenic family of VEGF isoforms VEGFxxxb in human kidney development[J].Nephron Physiol,2008, 110(4):57-67.

[6]PRITCHARD-JONES RO,DUNN DBA,QIU Y,et al.Expression of VEGFxxxb,the inhibitory isoforms of VEGF,in malignant melanoma[J].Br J Cancer,2007,97:223-230.

[7]RENNEL ES,HAMDOLLAH-ZADEH MA,WHEATLEY ER,et al. Recombinant human VEGF165b protein is an effective anti-cancer agent in mice[J].Eur J Cancer,2008,44(13):1883-1894.

[8]胡建莉,陳萍,劉偉,等.食管鱗癌中VEGF165b,HIF-1α的表達及臨床意義[J].腫瘤防治研究,2010,37(1):9-11.

[9]TAYAMA M,FURUHATA T,INAFUKU Y,et al.Vascular endothelial growth factor 165b expression in stromal cells and colorectal cancer[J].World J Gastroenterol,2011,17(44):4867-4874. [10]DAS K,ZHAO Y,SUGIONO M,et al.Differential expression of vascular endothelial growth factor165b in transitional cell carcinoma of the bladder[J].Uro Oncol,2007,25(4):317-321.

[11]姜翠蘋,王德林.膀胱移行細胞癌組織與正常組織中VEGF165b的差異表達及其意義[J].重慶醫科大學學報,2009,34(9):1137-1140.

[12]NOWAK DG,WOOLARD J,AMIN EM,et al.Expression of pro-and anti-angiogenic isoforms of VEGF is differentially regulated by splicing and growth factors[J].J Cell Sci,2008,121 (Pt 20):3487-3495.

[13]CIURA J,JAGODZI?SKI PP.Butyrate increases the formation of anti-angiogenic vascular endothelial growth factor variants in human lung microvascular endothelial cells[J].Mol Biol Rep, 2010,37(8):3729-3734.

（張蕾 編輯）

Expressions of VEGF165b and VEGF165 in gastric carcinoma and their correlations with prognosis*

Yun-yan GUAN1,Jing-fen ZHU1,Xi-long OU2,Hai-rong WU1,Xi-ping WU1,Qian WANG1
(1.Department of Gastroenterology,Wuxi Traditional Chinese Medicine Hospital,Wuxi,Jiangsu 214071,P.R.China;2.Department of Gastroenterology,the Affiliated Zhongda Hospital, Clinical Medical College,Southeast University,Nanjing,Jiangsu 210009,P.R.China)

【Objective】To investigate the expressions of VEGF165b and VEGF165 mRNA and proteins in gastric carcinoma and the adjacent normal tissue,and to investigate the correlation between the ratio of VEGF165b mRNA to VEGF165 mRNA in gastric carcinoma and the patients'prognosis.【Methods】The expressions of VEGF165b mRNA and VEGF165 mRNA in gastric carcinoma and the adjacent normal tissue were measured by RT-PCR and the expressions of VEGF165b and VEGF165 proteins were examined by immunohistochemistry.The relationships between the ratio of VEGF165b mRNA to VEGF165 mRNA and the patients'prognosis were determined.【Results】The ratio of VEGF165b mRNA to VEGF165 mRNA in the gastric carcinoma was lower than that in the adjacent normal tissue.The expressions of VEGF165b mRNA and protein were higher than those of VEGF165 in the normal tissue.However,the expressions of VEGF165b mRNA and protein were lower than those of VEGF165 in the gastric carcinoma tissue.There was a negative correlation between the protein expressions of VEGF165b and VEGF165.Furthermore,the ratio of VEGF165b mRNA to VEGF165 mRNA in the patients who were dead in two years was lower than that of the survivals.

VEGF165b;VEGF165;RT-PCR;immunohistochemistry;gastric carcinoma

R735.2

A

1005-8982（2015）27-0041-04

2015-05-26

無錫市科技局資助課題（No：CSE00907）

【Conclusions】Compared with the normal tissue,there is a predominant conversion from VEGF165b to VEGF165 in both mRNA and protein levels in gastric carcinoma,which can be a new target for treating gastric carcinoma.