七氟醚預處理對大鼠心肌缺血再灌注的影響與Caveolin-3 表達的關系

郝麗兵，焦麗媛，趙建力

(山西醫科大學， 山西 太原　030001)

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七氟醚預處理對大鼠心肌缺血再灌注的影響與Caveolin-3 表達的關系

郝麗兵，焦麗媛，趙建力*

(山西醫科大學， 山西 太原030001)

[摘要]目的：評價不同濃度及不同給藥模式七氟醚預處理對大鼠心肌缺血再灌注的影響及Caveolin-3在其中的作用。方法：采集健康雄性Wistar大鼠，使用改良Langedorff灌注裝置制備離體心臟灌注模型，將其均分為6組(n=10)：對照組(C組)、缺血再灌注組(IR組)、持續1.5%七氟醚預處理組(APC-1)、持續2.5%七氟醚預處理組(APC-2)、間斷1.5%七氟醚預處理組(APCI-1)和間斷2.5%七氟醚預處理組(APCI-2)。采用氯化三苯基四氮唑染色法評價離體心臟缺血再灌注損傷梗死面積，取左心室心肌細胞測定Caveolin-3的表達。結果：與對照組相比，缺血再灌注組心肌梗死面積增大，Caveolin-3表達下降，差異有統計學意義(P<0.05)。與缺血再灌注組相比，七氟醚預處理組心肌梗死面積減小，Caveolin-3表達上調，差異有統計學意義(P<0.05)。不同濃度及給藥模式的七氟醚預處理組間相比，持續給藥模式較間斷給藥模式組心肌缺血再灌注梗死面積減小，Caveolin-3表達上調最明顯，差別有統計學意義(P<0.05)，而不同濃度七氟醚組間心肌梗死面積、Caveolin-3表達無統計學意義(P>0.05)。結論：七氟醚預處理能減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷，縮小梗死面積；持續七氟醚預處理具有明顯的心肌保護作用其作用機制可能與上調Caveolin-3的表達有關。

[關鍵詞]七氟醚；心肌缺血再灌注損傷；缺血預處理； Caveolin-3

Effects of Sevoflurane Preconditioning on Myocardial Cells during Myocardial Ischemia-reperfusion in Rats and the Relationship of the Expression of Caveolin-3

HAO Libing, JIAO Liyuan, ZHAO Jianli

(ShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,Shanxi,China)

[ABSTRACT]Objective: To evaluate the effects of sevoflurane preconditioning with different concentration and different administration model on myocardial cells during myocardial ischemia-reperfusion in rats and the role of Caveolin-3. Methods：The healthy male SD rats were completely randomly assigned to 6 different groups (n=10 each) using a random number table, controlling group(group C)，I/R group, Lasting 1.5% sevoflurane preconditioning group(APC-1), Lasting 2.5% sevoflurane preconditioning group(APC-2), Intermittent 1.5% sevoflurane preconditioning group(APCI-1) and intermittent 2.5% sevoflurane preconditioning group(APCI-2). TTC(Triphenyl tetrazolium chloride) staining evaluated the infarct size of myocardial infarction, and immunohistochemistry evaluated the expression of Caveolin-3 on left ventricle. Results: Compared with the controlling group (group C), myocardial infarction area increased and Caveolin-3 expression decreased in group I/R. There was statistically significant difference(P<0.05). Compared with the group I/R, myocardial infarction area decreased, and Caveolin-3 expression raised in Sevoflurane preconditioning group. There was statistically significant difference(P<0.05). In different sevoflurane preconditioning group, myocardial infarction size decreased, and Caveolin-3 expression raised. There was statistically significant difference in last sevoflurane preconditioning group compared with intermittent sevoflurane preconditioning group(P<0.05). But myocardial infarction area and Caveolin-3 expression had no statistical significance in different concentrations of sevoflurane group(P>0.05).Conclusion: Sevoflurane preconditioning can attenuate myocardial ischemia reperfusion injury in rats, possibly associated with upregulated Caveolin-3 expression and narrowing the area of myocardial infarction. The effection of myocardial protection is the most obvious in continuing sevoflurane preconditioning group.

[KEYWORD] sevoflurane；myocardial reperfusion injury；ischemic preconditioning；Caveolin-3

隨著冠狀動脈旁路移植術、急性心肌梗死溶栓術及體外循環下心內直視手術等臨床治療手段的廣泛應用，術中均可能發生心肌缺血再灌注損傷。心肌缺血再灌注損傷是一種常見病理生理過程，涉及多個環節，長時間持續性缺血和再灌注可誘發心肌細胞凋亡，導致心肌細胞不可逆性死亡。已有研究證實，缺血預處理是最有效的心肌保護方法之一[1]，而七氟醚可發揮與缺血預處理相似的心肌保護效應。這為臨床心臟病人行心臟或非心臟手術時麻醉方案的選擇提供了理論依據。Caveolin-3是一種重要的膜結構蛋白和調節蛋白，可特異性地表達于心肌細胞，在維持細胞正常運轉以及信息傳導中起著重要作用，心肌研究提示它與心肌發育、營養和能量代謝密切相關[2-4]。本研究擬探討不同濃度及不同給藥模式七氟醚預處理對大鼠缺血再灌注心肌細胞的影響及Caveolin-3在其中的作用。

1材料和方法

1.1主要試劑與儀器

七氟醚(上海恒瑞醫藥股份有限公司)，K-H液(mmol/L：NaCl 118．5、NaHC0325.0、KCl 4．75、MgS041.2、KH2P041.2、CaCl22.5、葡萄糖1.11)，Caveolin-3單克隆抗體(Santa Cruz公司，美國)，七氟醚揮發罐(Dmger公司，德國)，麻醉氣體監測儀(Dmger Vamos公司，德國)，TTC染料(Amrecro公司)。

1.2動物選擇與模型制備

SPF級健康雄性Wistar大鼠60只，6～8周齡，體重280～360 g，由山西醫科大學實驗動物中心提供。適應性飼養3 d后，腹腔注射戊巴比妥鈉30 mg/kg麻醉，腹腔注射肝素1 000 IU/kg抗凝，迅速開胸取出心臟，放入4℃ K-H液中，修剪心臟周圍組織，輕輕擠壓心臟，洗清殘留血液，懸掛于Langendofff離體灌注裝置上固定。用37℃、95%O2和5%CO2混合氣體，持續充氣平衡30 min的K-H液灌注30 min，pH值7.35～7.45，灌注壓90 cm H2O(1 cm H2O=0.098 kPa)。

1.3實驗分組和處理

離體心臟60個，采用隨機數字表法，均分為6組(n=10)：對照組(C組)、缺血再灌注組(IR組)、持續1.5%七氟醚預處理組(APC-1)、持續2.5%七氟醚預處理組(APC-2)、間斷1.5%七氟醚預處理組(APCI-1)和間斷2.5%七氟醚預處理組(APCI-2)。C組繼續灌注K-H液90 min；IR行全心缺血30 min，再灌注60 min；持續1.5%七氟醚預處理組(APC-1)通過七氟醚揮發罐將1.5%七氟醚持續吹入K-H液中，用預充1.5%七氟醚的K-H液灌注15 min，之后行全心缺血30 min，再灌注60 min；持續2.5%七氟醚預處理組(APC-2)處理方法同APC-1；間斷1.5%七氟醚預處理組(APCI-1)通過七氟醚揮發罐將1.5%七氟醚持續吹入K-H液中，用預充1.5%七氟醚的K-H液灌注5 min，然后用K-H液灌注5 min，再次恢復含七氟醚的K-H灌注5 min，共計15 min，之后行全心缺血30 min，再灌注60 min；間斷2.5%七氟醚預處理組(APCI-2)處理方法同APCI-1。采用麻醉氣體監測儀監測七氟醚濃度。

1.4觀察指標

1.4.1離體心肌缺血再灌注梗死面積灌流結束后，每組隨機取5只，取下心臟，取刀片垂直心臟長軸將其橫切為5片，每片約為2 mm。展平后置于PBS(0.1 mol/L)溶解的1%TTC溶液中，37℃避光孵育20 min，取出后置于10%中性甲醛(0.1 mol/L PBS配制)中。于染色后l周對4個橫切片的正反兩面進行圖像采集[5]，照片采用Photoshop 3S Extended軟件計算梗死面積。梗死面積百分比(%)=梗死面積/橫切片總面積×100%。

1.4.2免疫組化檢測Caveolin-3表達取左心室心肌組織，多聚甲醛固定，石蠟包埋切片，脫蠟，山羊血清封閉，滴加Caveolin-3單克隆抗體(稀釋度1∶100)，4℃孵育過夜；滴加辣根過氧化物酶標記的大鼠IgG抗體(稀釋度1∶10 000)，37℃孵育30 min；DAB顯色，蘇木精復染。顯微鏡下觀察呈棕黃色染色為陽性，應用Image-Pro Plus圖像分析系統測定光密度值，反映Caveolin-3的表達[6]。

1.5統計學方法

2結果

2.1各組大鼠TTC染色心肌缺血再灌注梗死面積比較

與C組相比，IR組心肌梗死面積增大，差異有統計學意義(P<0.05)。與IR組相比，APC-1、APC-2、APCI-1、APCI-2組心肌梗死面積減小，差異有統計學意義(P<0.05)。不同濃度及給藥模式的七氟醚預處理組間相比，可見持續給藥模式較間斷給藥模式組心肌缺血再灌注梗死面積減小，差別有統計學意義(P<0.05)，而不同濃度七氟醚組間心肌梗死面積比較無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1　各組大鼠TTC染色心肌缺血再灌注梗死面積比較(±s)%Table 1　Comparison of the Area of Myocardial Infarction in Rats with TTC Staining in Each Group(±s)　%

2.2各組大鼠缺血再灌注心肌免疫組化Caveolin-3表達比較

與C組比較，IR組Caveolin-3表達下調(P<0.05)，差異有統計學意義。與IR組相比，APC-1、APC-2、APCI-1、APCI-2組Caveolin-3表達增加，差別有統計學意義(P<0.05)。不同濃度及給藥模式的七氟醚預處理組間相比，持續給藥模式較間斷給藥模式組Caveolin-3表達增高，差別有統計學意義(P<0.05)，而不同濃度七氟醚組間Caveolin-3表達無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2　各組大鼠缺血再灌注心肌Caveolin-3表達%Table 2　The Expression of Caveolin-3 on Myocardial Cells during Myocardial Ischemia-reperfusion in Rats(±s)　　%

3討論

在心肌缺血再灌注過程中，細胞凋亡是引起損傷的重要病理機制之一 。如何有效抑制心肌缺血所致細胞凋亡的發生和發展，從而促進缺血再灌注心肌功能恢復、減輕心肌致死性損傷，是研究探索的熱點。心肌細胞是不可再生細胞，通過表1可見，與對照組相比，缺血再灌注組心肌梗死面積增大，差異有統計學意義(P<0.05)。與缺血再灌注組相比，七氟醚預處理組心肌梗死面積減小，差異有統計學意義(P<0.05)。不同濃度及給藥模式的七氟醚預處理組間相比，可見持續給藥模式較間斷給藥模式組心肌缺血再灌注梗死面積減小，差別有統計學意義(P<0.05)，而不同濃度七氟醚組間心肌梗死面積比較無統計學意義(P>0.05)。

窯蛋白是細胞膜上的特異性囊狀小凹結構，由脂類(如膽固醇、鞘糖脂和鞘磷脂)和蛋白質組成。窯蛋白能與多種關鍵信號分子，如G蛋白、Ha-Ras、Src酪氨酸激酶家族成員、EGF受體、胰島素受體、PKC、eNOS，對其活性起負性調控作用，從而參與細胞分化、增殖、腫瘤發生、炎癥和細胞衰老等病理生理過程。窯蛋白可分為3種亞型，其中Caveolin-3于1996年首次鑒定，并發現高水平Caveolin-3僅存在于骨骼肌和心肌的微囊和T管，暗示微囊蛋白在肌細胞中有特殊作用,被認為是Caveolin參與心臟的缺血再灌注損傷保護作用的重要成分,Caveolin-3的作用通路已有初步研究，但具體機制尚未完全闡明。Caveolin-3可以通過與Ca2+-ATPase、G蛋白α亞單位、eNOS、Ras及上皮生長因子受體等的共同特異序列結合后，能抑制它們的活性，因此成為一個心臟的缺血再灌注保護作用研究的新治療靶點。通過表2可見，與對照組比較，缺血再灌注組Caveolin-3表達減少，差別有統計學意義(P<0.05)。與缺血再灌注組相比，七氟醚預處理組Caveolin-3表達增加，差別有統計學意義(P<0.05)。不同濃度及給藥模式的七氟醚預處理組間相比，持續給藥模式較間斷給藥模式組Caveolin-3表達增高，差別有統計學意義(P<0.05)，而不同濃度七氟醚組間Caveolin-3表達無統計學意義(P>0.05)。通過表1和表2可以看出，Caveolin-3表達增高時，心肌細胞缺血再灌注時心肌梗死面積減小。提示七氟醚預處理減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷的機制可能與上調Caveolin-3的表達有關。而七氟醚如何通過上調Caveolin-3表達而減輕心肌細胞梗死有待進一步研究。

[參考文獻]

[1]朱俊超,蘭培麗,李陽.七氟醚預先給藥對大鼠心肌缺血再灌注損傷時胱硫醚-合酶和血紅素氧合酶-1表達的影響[J].中華麻醉學雜志，2012,32(5)：600-603.

[2]Tang Z，Scherer PE，Okamoto T，etal．Molecular Cloning of Caveolin-3，a Novel Member of the Caveolin Gene Family Expressed Predominantly In Muscle[J]．J Biol Chem，1996，271(4)：2255-2261．

[3]Williams TM，Lisanti MP．The Caveolinproteins[J]．Genome Biol，2004，5(3)：214.

[4]黃勤,王庭槐.心肌細胞caveolin-3的相關信號轉導[J].國際病理科學與臨床雜志，2005,25(4)：297-299.

[5]王燕,胡慧媛,趙美瞇,等.TTC染色評價豚鼠離體心臟缺血/再灌注損傷梗死面積的適宜觀察時間及計算方法[J].中國醫科大學學報,2013,42(2):160-164.

[6]張彥清，趙建力，劉保江.七氟醚預處理對大鼠心肌缺血再灌注時窯蛋白-3表達的影響[J].中華麻醉學雜志，2014,34(1)：79-81.

本文編輯：王知平

[通訊作者]趙建力，男，副教授， E-mail：haolibing8@163.com

[作者簡介]郝麗兵，男，主治醫師，麻醉學碩士研究生在讀

[中圖分類號]R654.2

[文獻標識碼]A

[文章編號]1671-0126(2015)02-0003-04