免疫鼠抗AT1受體自身抗體的類型分布研究

鄭榮華，張蘇麗，劉慧榮

(1.臨汾職業技術學院，山西 臨汾　041000；2.首都醫科大學，北京　100069)

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免疫鼠抗AT1受體自身抗體的類型分布研究

鄭榮華1，張蘇麗2，劉慧榮2

(1.臨汾職業技術學院，山西 臨汾041000；2.首都醫科大學，北京100069)

[摘要]目的：明確免疫鼠血中抗AT1受體自身抗體的類型分布，為該抗體的作用機制研究提供一定的實驗依據。方法：以AT1R-ECII為抗原主動免疫雌性Wistar大鼠，待大鼠血清中含有高滴度的抗AT1受體自身抗體后，用ELISA法檢測血清中抗AT1受體抗體的水平、類型及亞類。結果：雌性Wistar大鼠免疫4周后，抗AT1受體抗體滴度時明顯升高，8周時處于穩定高峰值(免疫組OD值2.99±0.11 vs. 同期對照組0.44±0.06，P<0.05)；該抗體屬于免疫球蛋白的IgG類；在大鼠IgG的4個亞型(IgG1，IgG2a，IgG2b， IgG2c)中，該抗體大部分屬于IgG2b亞類(OD值為0.33±0.04 vs. 同期對照組OD值0.08±0.01，P<0.05)，極少部分屬于IgG2a亞型(OD值為0.10±0.01 vs. 同期對照組OD值0.07±0.05，P<0.05)。結論：通過主動免疫大鼠體內產生的抗AT1受體抗體主要屬于IgG類，IgG2b亞類。

[關鍵詞]AT1R受體；抗體；類型

Study on Distribution of the Types of Autoantibodies against AT1Receptor in the Sera of Immunized Rats

ZHENG Ronghua1, ZHANG Suli2, LIU Huirong2

(1.LinfenVocationalandTechnicalCollege,Linfen041000,Shanxi,China; 2.CapitalMedicalUniversity,Beijing100069,China)

[ABSTRACT]Objective: To detect distribution of the types of autoantibodies against AT1receptor in the sera of immunized rats, providing the experimental basis for the research of the action mechanism. Methods: Adult female Wistar rats were actively immunized with AT1R-ECII. When the titer of anti-AT1R antibody reached a peak, the titers, types and subtypes of anti-AT1R antibody in the sera of rats were detected by SA-ELISA. Results: The titers of serum anti-AT1R antibody in immunized group were increased at the 4th week and attained a peak value at the 8th week as compared with the control group at the same time point(OD value, 2.99±0.11 vs. 0.44±0.06, P<0.05). It was shown that anti-AT1R antibody was IgG type immunoglobulin(IgG1, IgG2a,IgG2b, IgG2c). Meanwhile, the antibody was mainly determined as IgG2b subtype(OD value, 0.33±0.04 vs. 0.08±0.01, P<0.05), and a few belonged to IgG2a subtype(OD value, 0.10±0.01 vs. 0.07±0.01, P<0.05).Conclusion:The anti-AT1R antibodies in immunized rats aremainly determined as IgG2b subtype, and a few belongs to IgG2a subtype.

[KEYWORD] AT1receptor; antibodies; types

先兆子癇患者的發病與抗血管緊張素Ⅱ1型受體自身抗體(AT1-AA)密切性備受關注[1]。但由于臨床研究具有的局限性及抗體收集的困難性，有關這些抗體與疾病的相關性研究大多數集中到動物身上，其中較為廣泛采用的是主動免疫大鼠獲取相應抗體而進行進一步機制研究。本研究通過主動免疫大鼠體內產生的抗AT1受體抗體，測定其類型及亞類的分布，為先兆子癇患者發病機制的研究提供一定的實驗依據。

1材料與方法

1.1材料

Wistar雌性大鼠由山西醫科大學實驗動物中心提供，年齡體重相當。佐劑購自美國Sigma公司。北京中杉金橋生物技術有限公司提供生物素化羊抗兔IgG、IgA、IgM、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c二抗、親和素標記辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)。酶聯免疫測定儀為該實驗室購自美國Molecular Device產品。

1.2方法

1.2.1主動免疫動物模型的建立隨機將11只Wistar雌性健康大鼠，分為對照組(n=6)和免疫組(n=5)。用合成的人AT1受體細胞外第二環肽段(AT1R-ECII)為抗原進行免疫，每2周加強免疫1次，每次免疫前鼠尾采血，-40℃備用。

1.2.2血清抗AT1R抗體的檢測采用SA-ELISA法檢測免疫雌鼠體內抗AT1R抗體產生情況[2]，并測定該血清抗體的類型及亞類，其中二抗濃度分別為IgA(1∶8 000)、IgM(1∶3 000)、IgG1(1∶6 000)、IgG2a(1∶6 000)、IgG2b(1∶8 000)、IgG2c(1∶8 000)，于405 nm波長處測定OD值。

1.3統計學方法

2結果

2.1建立主動免疫大鼠模型

到免疫4周時，大鼠血清中已明顯檢測出抗AT1R抗體，8周時達穩定值(稀釋度1∶10時OD值2.99±0.11vs. 0.44±0.06，P<0.05，見圖1)。

2.2免疫鼠血中抗AT1R抗體類型及亞類

用ELISA方法檢測證明免疫雌鼠血清中抗AT1R抗體屬于IgG類(OD值2.79±0.02 vs. 0.40±0.05，P<0.05)，而非IgM及IgA類(vs. 同期對照組，P>0.05,見圖2)。該抗體以IgG2b亞型為主(OD值0.33±0.04 vs. 0.08±0.01，P<0.05)，極少部分屬于IgG2a亞型(OD值0.11±0.01 vs. 0.07±0.01，P<0.05，見圖3)。

圖1　免疫不同時間段抗AT1R抗體水平值

圖2　抗AT1R抗體的類型分布

圖3　抗AT1R抗體亞類分布

3討論

在先兆子癇發病機制的研究中，從發現抗血管緊張素Ⅱ1型受體的自身抗體(AT1-AA)存在后，AT1-AA與先兆子癇疾病發展的相關性引人關注。AT1-AA在疾病中發揮多種的病理生理效應，與該抗體的類型密切相關。但是由于臨床研究的局限性，關于AT1-AA在先兆子癇疾病中的作用機制研究受到很大的限制。

AT1-AA與疾病的相關性研究大多數集中到動物身上，其中較為廣泛采用的是主動免疫大鼠獲取相應抗體而進行進一步機制研究。本實驗通過免疫獲得的抗AT1R抗體其性質屬于IgG類免疫球蛋白，這與 Dechend等[3]證實的先兆子癇患者血中的AT1-AA類型恰巧一致，并且IgG是唯一可通過胎盤的免疫球蛋白，這一結果提示通過免疫大鼠獲得的抗AT1R抗體與先兆子癇患者體內AT1-AA性質具有相似性。

本研究檢測進一步發現，免疫大鼠血清中的抗AT1受體抗體大部分為IgG2b類，極少部分屬于IgG2a。大鼠的IgG共有4個亞型，分別為IgG1，IgG2a，IgG2b， IgG2c，其中IgG2b和IgG2a類與FcRn結合力強，而IgG的胎盤穿透功能與IgGFc片段結構有關，說明免疫大鼠獲得的抗AT1R抗體具有經胎盤傳播的可能性。抗AT1受體抗體亞類主要為IgG2b，主要受輔助性T細胞1(Th1)型調節，是參與炎癥相關的抗體類型，與先兆子癇患者體內表現炎癥反應過度相吻合[4]。抗AT1R抗體亞類的研究，再次提示免疫鼠血中的抗AT1R抗體與臨床上先兆子癇患者體內AT1-AA具有一致性基礎。

綜上所述，本研究利用主動免疫大鼠獲得的抗AT1R抗體，能夠成為先兆子癇發病機制研究的一種工具。

[參考文獻]

[1]任玉玲，金達茂，馬成文，等. 腦卒中患者血清抗血管緊張素受體Ⅱ1型和α1腎上腺素受體自身抗體的觀察[J]. 中國神經免疫學和神經病學雜志，2005，12(1)：53.

[2]鄭榮華，王澎，張蘇麗，等.抗血管緊張素Ⅱ1型受體抗體陽性孕鼠模型的制備[J].中國心血管病研究，2010，8(4): 290-293.

[3]Dechend R, Dominik NM, Wallukat G,etal. AT1Receptor Agonistic Antibodies,Hypertension, and Preeclampsia[J]. Elsevier Inc. 2004，24:571-579 .

[4]鄭榮華.抗AT1受體自身抗體對人體胎盤血管的收縮作用[D]. 太原：山西醫科大學，2010.

本文編輯：王知平

·基礎醫學·

[作者簡介]鄭榮華，女，講師，從事生理學教學工作及相關教學管理工作

[基金項目]國家自然科學基金青年科學 (30900584)

[中圖分類號]R714.24+4

[文獻標識碼]A

[文章編號]1671-0126(2015)02-0001-03