兩種檢測柯薩奇病毒B組IgG抗體膠體金方法的建立及比較

閻建棟，郭　斌，華　艷

(1.太原市第四人民醫院，山西 太原　030053；2.北京英諾特生物技術有限公司，北京　100070)

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兩種檢測柯薩奇病毒B組IgG抗體膠體金方法的建立及比較

閻建棟1，郭斌1，華艷2

(1.太原市第四人民醫院，山西 太原030053；2.北京英諾特生物技術有限公司，北京100070)

[摘要]目的：建立兩種膠體金反應體系檢測柯薩奇病毒B組IgG抗體并進行比較，選出合適的檢測方法。方法：利用膠體金標記柯薩奇重組抗原做金標墊，鼠抗人IgG包被做檢測線建立捕獲法反應體系；利用膠體金標記鼠抗人IgG做金標墊，包被柯薩奇重組抗原做檢測線建立間接法反應體系，通過實驗選出性能較好的試劑盒并與進口試劑盒(酶聯免疫法)進行臨床標本比對實驗。結果：捕獲法同臨床已知樣本的陽性符合率和陰性符合率分別為97.96%和98.80%，總符合率達到98.67%，間接法同臨床已知樣本的陽性符合率和陰性符合率分別為93.88%和98.80%，總符合率達到98.00%；在抗干擾實驗中，捕獲法與間接法對ANA陽性、高脂、黃疸共47例干擾因子樣本均有較好的抗干擾性能；但在檢測RF陽性樣本時，間接法體系研制而成的試劑出現1例假陽性反應；對600例臨床樣本進行檢測，柯薩奇病毒B組IgG抗體捕獲膠體金檢測試劑與進口試劑盒的陽性符合率和陰性符合率分別為97.82%和99.40%，總符合率達到99.17%。結論：經初步臨床應用，表明利用捕獲法原理建立的檢測試劑盒比利用間接法建立的更靈敏，抗干擾性能更強，而且與進口試劑盒比對，有較高的靈敏度和特異性，具有較好的應用前景。

[關鍵詞]柯薩奇病毒B組；捕獲法；間接法；膠體金法

Establishment and Comparison of Two Different Methods of Testing Coxsackievirus B IgG Antibody

YAN Jiandong1, GUO Bin1, HUA Yan2

(1.TheFourthPeople'sHospitalofTaiyuanCity,Taiyuan030053,Shanxi,China; 2.BeijingYingNuoTeBiotechnologyCo.Ltd.Beijing100070,China)

[ABSTRACT]Objective: To establish two kinds of colloidal gold reaction system to detect coxsackievirus B IgG antibody with the appropriate method chosen through comparison. Method: Using the coxsackievirus B recombinant antigen labeled with colloidal gold as the conjugate pad, the test line was packed with the monoclonal antibody to human IgG to build the capture reaction system; Using the monoclonal antibody to human IgG labeled by colloidal gold on the pad, the test line was packed with the recombinant antigen to build the indirect reaction system. Results: The colloidal gold capture kit had a positive coincidence rate of 97.96%, negative coincidence rate of 98.80%, crude consistency of 98.67%; the colloidal gold indirect kit had a positive coincidence rate of 93.88%, negative coincidence rate of 98.80%, crude consistency of 98.00%. In the interference test, testing of 47 serum samples indicated that both of them had good interference ability, only one false positive result occurred using the colloidal gold indirect kit. Testing of 600 serum samples indicated that this colloidal gold capture kit had a sensitivity of 97.82%, specificity of 99.40%, crude consistency of 99.17%, compared to the imported CVB-IgG ELISA kit; Conclusion:As can be seen in the pretiminary clinical use, the colloidal gold capture kit has higher sensitivity and more capacity than the indirect one by the experiments. Compared to imported reagents, the colloidal gold capture kit has higher sensitivity and specificity with a good prospects.

[KEYWORD] coxsackie virus B; capture; indirect method; colloidal gold

柯薩奇病毒B組(coxsackievirus B，CVB)是1954年在美國紐約州柯薩奇鎮被發現的，是微小RNA病毒科腸道病毒屬成員，有6個血清型，病毒侵犯不同的器官而臨床病癥表現各異[1,2]，可引起從上呼吸道到中樞神經系統感染的許多疾病。是引起人類病毒性心肌炎、無菌性腦膜炎和新生兒全身性感染等疾病的主要病原，可在世界各地散發或暴發流行，近年來其發病呈顯著上升趨勢。病毒性心肌炎的病例中大約有20%～25%是由柯薩奇病毒B組引起[3]。近年研究顯示1、2型糖尿病的發生也與柯薩奇病毒B組的感染有一定相關性[4]。CVB的致病機制十分復雜，病毒基因組以及病毒蛋白均在病毒致病過程中發揮重要作用[5]。

病毒的攜帶者及患者均為傳染源。病毒主要從糞便中排出，也可從咽喉部排出，主要通過腸道傳播，也可經污染的手、食品、衣服、用具等傳播。在嬰兒室內柯薩奇病毒感染患兒、醫護人員以及哺乳的產婦均可成為本病散發或流行的傳染源[6]。因此柯薩奇病毒B組病毒感染的檢測對疾病的預防及治療具有非常重要的意義。

1實驗材料

1.1原料

柯薩奇病毒重組抗原購自北京鉑萊瑞生物技術有限公司。

1.2試劑盒

柯薩奇B組病毒IgG抗體檢測試劑盒，購自北京貝爾生物工程有限公司；柯薩奇病毒B組 IgG抗體檢測試劑盒(酶聯免疫法)，購自北京現代高達生物技術有限公司；柯薩奇病毒 IgG 試劑盒為進口試劑盒，購自VIRION (U.S.)。

1.3血清樣本

收集2013年10月太原市第四人民醫院300例經確認的門診及住院患者血清樣本，主要包括咽炎、肺炎、支氣管炎等呼吸道感染患者的血清樣本，其中陽性49例，陰性251例。

收集47例干擾因子，其中抗核抗體(ANA)陽性血清樣本12例、類風濕因子(RF)陽性血清樣本15例、高脂血清樣本10例、黃疸血清樣本10例。

另外，從不同醫院隨機收集600例具有疑似呼吸道感染癥狀的患者血清樣本，多數為青少年及嬰幼兒血清。

2實驗方法

2.1最佳反應體系的選擇

2.1.1間接法反應體系的建立按經典的氯化金-檸檬酸三鈉還原法制備膠體金液。用柯薩奇重組抗原和羊抗鼠IgG單克隆抗體包被硝酸纖維素膜，并用方正滴定法確定最佳包被濃度，膠體金標記鼠抗人IgG(抗γ鏈)抗體和小鼠IgG抗體為示蹤物，加入待檢血清，觀察檢測線和質控線位置顏色的變化。

2.1.2捕獲法反應體系的建立按經典的氯化金-檸檬酸三鈉還原法制備膠體金液。用鼠抗人IgG(抗γ鏈)抗體和羊抗鼠IgG單克隆抗體包被硝酸纖維素膜，并用方正滴定法確定最佳包被濃度，膠體金標記柯薩奇重組抗原和小鼠IgG抗體為示蹤物，加入待檢血清，觀察檢測線和質控線位置顏色的變化。

2.1.3兩種反應體系的性能比較通過對300例經北京貝爾公司和北京高達公司試劑盒確認陰陽性的樣本同時進行檢測，分別計算陽性符合率和陰性符合率，同時對47例干擾因子分別進行抗干擾實驗。

2.2與進口試劑盒的性能比較

通過比較選擇性能較好的反應體系與VIRION (U.S.)生產的柯薩奇病毒 IgG 試劑盒對臨床隨機樣本進行對比檢測。

3結果

3.1最佳反應體系的建立

3.1.1間接法反應體系的建立用柯薩奇病毒B組重組抗原和羊抗鼠IgG單克隆抗體包被硝酸纖維素膜，包被濃度為1.0 mg/mL，包被量為1.0 μL/cm。

膠體金標記鼠抗人IgG(抗γ鏈)抗體和小鼠IgG抗體為示蹤物，經實驗確認，鼠抗人IgG(抗γ鏈)抗體金標記物噴點量為50.0 μL/cm2，小鼠IgG金復合物最佳包被量為16.0 μL/cm2，最佳反應時間為20 min。

3.1.2捕獲法反應體系的建立用鼠抗人IgG(抗γ鏈)和羊抗鼠IgG單克隆抗體包被硝酸纖維素膜，包被濃度都為1.0 mg/mL，包被量為1.0 μL/cm。

膠體金標記柯薩奇病毒B組重組抗原和小鼠IgG抗體為示蹤物，經實驗確認，最終選擇柯薩奇病毒B組重組抗原金標記物噴點量為60.0 μL/cm2，小鼠IgG金復合物最佳包被量為14.0 μL/cm2，反應時間為20 min。

3.1.3兩種反應體系性能的判定比較用間接法和捕獲法建立的柯薩奇B組病毒IgG抗體膠體金檢測試劑與北京貝爾生物技術有限公司的柯薩奇B組病毒IgG抗體檢測試劑盒(酶聯免疫法)對300例血清樣本和47例干擾因子樣本分別進行對比檢測，結果見表1~3。

表1　捕獲法膠體金與貝爾酶免試劑對比檢測結果 例Table 1　Comparison of Results between the Capture CG Method and Biaer Elisa Kit case

北京英諾特生物技術有限公司根據捕獲法反應體系研制的《柯薩奇病毒B組IgG抗體檢測試劑盒(膠體金法)》檢測結果與貝爾公司試劑檢測結果具有較高的符合性，陽性符合率為97.96%，陰性符合率為98.80%，總體符合率98.67%，Kappa值為0.95。見表1。

表2　間接法膠體金試劑與貝爾酶免試劑對比檢測結果 例Table 2　Comparison of Results between the Indirect CG Method and Biaer Elisa Kit case

表2數據表明，北京英諾特生物技術有限公司根據間接法反應體系研制的《柯薩奇病毒B組IgG抗體檢測試劑盒(膠體金法)》臨床檢測結果與貝爾公司試劑檢測結果具有較高的符合性，陽性符合率為96.13%，陰性符合率為98.99%，總體符合率98.56%，Kappa值為0.94。

表3　兩種體系抗干擾實驗 例Table 3　Comparison of Anti-interference Results between Two Systems case

表3結果顯示，捕獲法與間接法對ANA陽性、高脂、黃疸等樣本均有較好的抗干擾性能；但在檢測RF陽性樣本時，根據間接法體系研制而成的膠體金試劑出現了1例假陽性結果。雖然不排除該樣本本身所含IgG抗體含量造成的誤差，但捕獲法在抗原抗體反應中，僅針對特異性抗COX-B IgG抗體進行捕捉，抗干擾能力更強。

3.2與進口試劑盒的判定比較

用VIRION (U.S.)生產的柯薩奇病毒 IgG 試劑盒與北京英諾特生物技術有限公司根據捕獲法反應體系研制的《柯薩奇病毒B組IgG抗體檢測試劑盒(膠體金法)》對臨床收集的 600例血清樣本進行對比檢測，結果見表4。

數據表明，北京英諾特生物技術有限公司研制的《柯薩奇病毒B組IgG抗體檢測試劑盒(膠體金法)》臨床檢測結果與VIRION公司試劑檢測結果具有較高的符合性，陽性符合率為97.92%，陰性符合率為99.40%，總體符合率99.17%，Kappa值為0.97，具有高度一致性。

表4　捕獲法與VIRION試劑盒臨床標本比對結果 例Table 4　Comparison of Results between the Capture Method and VIRION Kit case

4討論

目前科薩奇病毒感染的檢測方法主要有病毒分離、血清學檢測和PCR檢測及斑點雜交。其中病毒分離需要選擇孕母及患兒的早起分泌物(咽拭子、直腸拭子、便、血液、腦脊液及組織細胞等)進行分離培養，以提高病原體的陽性檢出率。而國內外學者從80年代開始就將分子病毒學技術應用于病毒病原學診斷，用核酸雜交的方法檢測血清及心肌標本中的腸道病毒DNA及RNA[7]。此方法敏感性強，特異性高且具有快速的特點，但由于這兩種方法對專業技術和設備都有很高的要求，無法廣泛使用。

而血清學檢查具有簡便快速的特性使其在臨床上得到廣泛應用，現在CVB血清學檢查主要應用的方法有中和實驗和間接免疫熒光技術。但中和實驗需要較長的檢測周期，也不太適用于一般的臨床應用。

目前國內市場上用于檢測柯薩奇病毒B組感染的血清學試劑非常稀少，并且都采用酶聯免疫學方法來檢測CVB-IgG。但該法檢測所需時間長，操作步驟繁瑣、易受類風濕因子等因素的影響，所以結果不穩定。而膠體金法與酶聯免疫分析法比較具有便捷、快速、操作簡單等多方面的優點。

本次研究根據間接法和捕獲法原理分別研制的《柯薩奇病毒B組IgG抗體檢測試劑盒(膠體金法)》，對臨床樣本和干擾因子進行對比檢測。結果表明，根據捕獲法原理研制的《柯薩奇病毒B組IgG抗體檢測試劑盒(膠體金法)》具有更高的靈敏度和抗干擾能力，并通過與VIRION (U.S.)生產的柯薩奇病毒 IgG試劑盒進行比較，陽性符合率為97.92%，陰性符合率為99.40%，總體符合率99.17%，Kappa值為0.97。研究結果表明，北京英諾特生物技術有限公司采用捕獲法研制的《柯薩奇病毒B組IgG抗體檢測試劑盒(膠體金法)》能有效抗干擾，靈敏度、特異性與進口同類產品具有高度的一致性，而且操作方便、快速、節約成本，檢測結果的判定不需要其他設備，具有很好的應用價值。

[參考文獻]

[1]胡開華, 黃開瓊, 邱練芳, 等. 成都市成人病毒性心肌炎的柯薩奇B組病毒病原學的研究[J]. 中華實驗和臨床病毒學雜志, 1992, 6(2):193-195.

[2]趙錦銘, 丁韻珍, 王樹欣, 等. 北京地區病毒性心肌炎的病毒病因研究[J]. 中華兒科雜志, 1984, 22(4):167.

[3]孫靈梅，姜淑華，孫桂芳，等．柯薩奇B組病毒感染對上呼吸道感染患兒病程的影響[J]．濱州醫學院學報，2004，27(1)：63-64．

[4]溫江濤，趙長李，世寶新，等．柯薩奇病毒B組和人巨細胞病毒感染與1、2型糖尿病的相關性研究[J].中華臨床醫師雜志, 2014,8(16):101-105.

[5]劉發娣,黃孝天,劉金輝.柯薩奇B組病毒致病性的分子生物學研究[J].醫學分子生物學雜志, 2010,7(1):70-73.

[6]李娟,魏秀清,魏克倫.圍生兒柯薩奇病毒感染的流行病學及其臨床特點[J].中國實用婦科與產科雜志,2005,21(6):332-333.

[7]姜慶利，檢測柯薩奇病毒、副流感病毒基因芯片的建立[D].長春：吉林大學,2013.

本文編輯：王知平

[作者簡介]閻建棟，男，醫師，從事呼吸內科及結核病臨床研究

[中圖分類號]R446.5

[文獻標識碼]A

[文章編號]1671-0126(2015)02-0015-04