益氣活血方對冠心病心氣虛大鼠模型心肌細胞凋亡的影響

孔春明，邱麗芬，張紅梅，馬月香

（1.山東中醫藥大學，山東濟南250014； 2.濟南市歷下區人民醫院，山東 濟南250355）

冠心?。╟oronary artery heart disease，CHD）是臨床常見病、多發病，其發病率有逐年遞增的趨勢。中醫學中沒有“冠心病”病名，依據其臨床表現，辨證多屬于“胸痹”“心痛”等范疇，中醫在CHD的治療方面發揮著獨到的優勢。研究表明在冠心病所有的中醫辨證分型中以氣虛型所占比例最多［1-2］。對于“氣”在冠心病發病中的重要作用的認識古已有之。如清代魏荔彤提倡胸痹的病機為“氣血凝滯”說，論述曰：“胸痹者，痹于胸也。痹病，風挾寒濕之邪客于分肉，本在軀殼之表，何有痹于胸者？……唯陽氣虛極，斯氣血凝聚，遲緩膠固，所以至于胸痹而心亦痛也。”（《金匱要略本義》）明代汪機對于本病病因的論述曰：“未有不由氣滯而致者，古方皆用行氣散氣之劑，治而愈之。”（《醫學原理》）因此對于冠心病心氣虛的研究具有重要的意義。本研究通過對冠心病心氣虛大鼠模型進行益氣活血方藥的干預治療，觀察各組大鼠心肌細胞凋亡的形態學改變，以探討益氣活血方藥對冠心病心氣虛大鼠模型心肌細胞凋亡的影響，為中藥治療冠心病心氣虛證提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 Wistar雄性大鼠，體重（200±20）g，北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK（京）2012-0001。

1.1.2 實驗中藥 人參、黃芪、丹參、川芎中藥飲片，均由山東中醫藥大學附屬醫院提供。

1.1.3 試劑與儀器 石蠟切片機（德國，Leica）、石蠟包埋機（德國，Leica）、光學顯微鏡（日本，Olympus）、蘇木素伊紅（HE）染色試劑盒（產品編號C0105，碧云天生物技術公司提供）、小動物呼吸機（河北醫科大學儀器廠）、手術包（山東中醫藥大學附屬醫院）；左旋硝基精氨酸（L-NNA，Sigma公司）、鹽酸地爾硫（天津田邊制藥有限公司）。

1.2 實驗方法

Wistar雄性大鼠隨機分為空白組、模型組、假手術組、西藥組，益氣活血方低、中、高劑量組，每組10只。大鼠經10%水合氯醛250 mg/kg腹腔注射麻醉。無菌條件下氣管切開、插管、上動物呼吸機正壓輔助呼吸。胸部去毛，消毒，沿左鎖骨中線縱行切開皮膚2 cm，在第四或五肋間鈍性分離肌層，打開胸腔，剪開心包，輕壓右側胸廓，快速擠出心臟，在左冠狀動脈前降支中上1/3處行結扎后把心臟放回胸腔。逐層關胸，待動物蘇醒后拔氣管插管。24 h后以心電圖ST段下移和T波改變為標準判斷其為CHD大鼠模型。術后每只大鼠每天肌注青霉素10萬U預防感染。術后大鼠于常規喂養1 w后，空白組和假手術組給予生理鹽水1 mL，腹腔注射4 w。其余各組以15 mg/（kg·d）左旋硝基精氨酸分2次腹腔注射4 w［3］。造模成功后益氣活血方低、中、高劑量組分別灌服低、中、高不同濃度梯度的益氣活血中藥煎劑1.6 mL/100 g；西藥組每日按體重以30 mg/kg灌服鹽酸地爾硫 混懸液1.6 mL/100 g；空白組、假手術組、模型組以1.6 mL/100 g灌服生理鹽水。

1.3 心肌細胞凋亡檢測

45 d后進行麻醉，取心肌組織，HE染色檢測結扎處心肌細胞形態學變化。取心肌組織進行固定并按常規方法進行石蠟包埋、切片，按照蘇木素伊紅（HE）染色試劑盒說明進行組織染色，觀察結扎處心肌細胞形態學改變。

2 結 果

空白組大鼠心肌細胞排列整齊，輪廓清晰，細胞核完整，胞質均勻；假手術組心肌細胞排列較為整齊，見少量肌細胞呈波浪狀改變，細胞間隙均勻，少量炎性細胞浸潤；模型組心肌細胞排列紊亂，細胞壞死，較多炎性細胞浸潤，細胞核固縮變形甚至脫失，血管管腔增大，組織間隙明顯增寬并充填有大量纖維組織，橫紋模糊斷裂；西藥組、益氣活血方低劑量組、益氣活血方中劑量組心肌細胞變性、壞死程度較模型組有改善，血管擴張程度減輕，少量炎性細胞浸潤；益氣活血方高劑量組心肌細胞排列較為整齊，未見明顯炎性細胞浸潤，無明顯血管擴張，纖維增生程度較模型組減輕明顯。結果見圖1~圖7。

3 討 論

圖1 空白組心肌組織病理特征

圖2 假手術組心肌組織病理特征

圖3 模型組心肌組織病理特征

圖4 西藥組心肌組織病理特征

圖5 低劑量組心肌組織病理特征

圖6 中劑量組心肌組織病理特征

圖7 高劑量組心肌組織病理特征

有研究表明，心肌細胞的凋亡不僅與心肌重塑有關，而且會促進心力衰竭的發生和發展及惡化，這可能與心肌細胞的缺失有關。心肌細胞的凋亡及數量的減少會導致心肌收縮力的降低，進而影響心功能［4］。有研究表明，冠心病心氣虛證與心功能的降低關系密切［5-8］。本研究發現，模型組心肌組織壞死嚴重而益氣活血方高劑量組可以改善心肌組織的壞死程度，進而改善心功能，進一步表明對心功能的評價與判斷可以作為冠心病心氣虛的診斷依據。

本實驗發現模型組心肌細胞排列紊亂，細胞壞死，較多炎性細胞浸潤，細胞核固縮變形甚至脫失，血管管腔增大，組織間隙明顯增寬并充填有大量纖維組織，橫紋模糊斷裂。本課題前期臨床研究發現冠心病心氣虛患者普遍存在血漿兒茶酚胺類物質的升高改變。而且有學者將60例CHD患者分為40例心氣虛證和20例非心氣虛證，檢測血漿（E、NE），結果顯示心氣虛證患者血漿中NE、E均升高，與非心氣虛證組及正常組比較差異顯著（P<0.01）［9］。CHD 心氣虛證患者血漿中兒茶酚胺明顯升高，說明冠心病心氣虛心肌細胞的凋亡與兒茶酚胺類物質的變化關系密切，而益氣活血方高劑量組能夠抑制并扭轉心肌細胞的凋亡，而減輕心肌缺血缺氧導致的細胞損傷，說明中藥益氣活血方可能是通過改變血漿兒茶酚胺類物質的含量從而起到改善心功能的作用。我們前期研究發現Gs-AC-cAMP-PKA信號通路介導的RyR2開放異常，可以引起心肌收縮力的降低。開放異常是由于當兒茶酚胺類物質含量升高時，使β-腎上腺素受體被持續激活，導致PKA過量產生，心肌細胞內RyR2被過度磷酸化，導致RyR2通道功能性關閉不全，造成RyR2通道的舒張期鈣滲漏，繼而肌漿網內鈣庫內的鈣離子量減少，影響收縮期細胞內的Ca2+濃度，進而導致心肌細胞內用于心肌興奮收縮耦聯所需的Ca2+減少，心肌收縮力降低，發生心功能減退。由此我們可以推測Gs-AC-cAMP-PKA信號通路介導的RyR2開放異常很可能是引起心肌細胞凋亡的原因，具體作用機制有待于實驗的進一步論證。

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