右歸飲促異體骨髓細胞向成骨分化防治輻照后骨量丟失機制的實驗研究

夏臣杰，尹利明，黃杰烽，陳俊杰，趙 凱，杜文喜

（1.浙江中醫藥大學第一臨床醫學院，浙江杭州310053； 2.浙江中醫藥大學附屬第一醫院，浙江杭州310053；3.新安國際醫院，浙江嘉興 314031）

骨量丟失是暴露于電離輻射（ionizing radiation，IR）后常見的病理改變［1-3］，嚴重者可致骨質疏松性骨折，臨床多見于轉移性骨腫瘤放療后的患者，給病人帶來了巨大的痛苦及沉重的經濟負擔。骨髓干細胞（bone marrow stem cell，BMSC）是一類具有自我更新和多向分化增殖潛能的原始骨髓細胞，已有研究表明，其在右歸飲作用下顯著促其向成骨細胞分化［2］。但目前尚缺乏右歸飲對骨髓細胞在動物體內分化情況的研究。故本實驗設計采用γ輻射破壞殺死骨髓細胞，造成骨量丟失，觀察右歸飲對回輸的同種異體骨髓細胞在小鼠體內向成骨細胞分化的影響，研究其防治輻照后骨量丟失的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物及分組 80只8 w齡SPF級雄性BALB/c小鼠［由上海西普爾-必凱實驗室動物有限公司提供；生產許可證號：SCXK（滬）2013-0016］，體重為（20±2）g，隨機選32只用于骨髓細胞提取回輸，實驗組48只。

1.1.2 實驗儀器 小動物成像儀（浙江省中醫藥大學骨傷研究所提供），輻照裝置（浙江省農科院提供）。

1.1.3 右歸飲制作 稱取1倍量處方右歸飲51 g（熟地9 g，炒山藥6 g，山茱萸3 g；枸杞6 g，炙甘草6 g，姜制杜仲 6 g，肉桂 6 g，制附子 9 g），加適量水浸泡1 h，提取1.5 h/次，提取2次，加10倍水，所得提取液趁熱過4層紗布后合并，放冰箱內冷藏12 h后，以4 000 r/min，3℃離心15 min，共2次。合并上清液，加熱至沸騰，趁熱放置冰箱內冷藏12 h后，再以4 000 r/min，3℃離心15 min，共2次，合并上清液，濃縮到密度為1.35，于60℃減壓干燥。干燥物碾細，過120目篩后得到右歸飲細粉，加熱水化開，4℃冰箱冷藏備用。

1.1.4 骨髓干細胞提取 斷頸處死小鼠，投入盛有250 mL左右的75%酒精中浸泡3～5 min，拎出后將小鼠仰面翻鋪于超凈臺上一個消毒托盤上。每只小鼠用2.5 mL PBS溶液沖洗骨髓腔內的細胞，1 200 r/min，離心10 min，去上清，留1 mL。懸浮細胞后加氯化銨溶 液 （NH4Cl：8.99 g/L，KHCO3：1 g/L，EDTA-4Na：0.037 g/L，過濾滅菌，40℃儲存）裂解紅細胞，按 1∶9比例，即1 mL細胞懸液加進9 mL NH4Cl溶液，混勻，置冰上10 min。1 200 r/min，10 min，去上清。置于4℃冰塊盒中，備用。

1.2 實驗方法

1.2.1 電離輻射造模 在進行骨髓提取同時，將實驗組小鼠隨機選8只作為空白對照組。將剩余40只小鼠，分裝在8個紙筒內，兩端用紗布扎緊，置于無菌的小鼠專用運輸盒內，運至浙江省農科院，予以電離輻射，輻射劑量為1 Gy/min，輻射6 min。然后運回浙江中醫藥大學動物實驗中心，隨機分成5組，即輻照組、BM回輸組、高劑量組、中劑量組、低劑量組，每組8只。

1.2.2 干預措施 空白對照組不予任何處理；輻照組只接受電離輻射；BM回輸組在電離輻射基礎上，按照1∶1比例，尾靜脈回輸骨髓細胞；高劑量組、中劑量組、低劑量組在電離輻射和骨髓細胞回輸的基礎上，分別予以 0.03 mL/g、0.02 mL/g、0.01 mL/g 濃度為0.51 g/mL的右歸飲灌胃，每天1次，持續2 w。

1.2.3 血清生化指標檢測 2 w后摘除眼球取血，置于離心管中，低溫條件4℃下放置4 h后，按照3 000 r/min離心15 min后取上層血清，進行堿性磷酸酶（ALP）檢測。

1.2.4 股骨單位體積內骨量（即骨密度）檢測 眼球取血后，斷頸處死小鼠，整體動物采用小動物成像儀拍攝后測定骨密度。掃描小鼠雙側股骨，保存數據，使用骨密度測定軟件分別測定雙側股骨骨密度。

1.2.5 組織學觀察 檢測完骨量，取雙側股骨上段，剔凈軟組織，行石蠟包埋、5 μm切片、HE染色，進行組織病理觀察。

1.3 統計學方法

用SPSS 19.0進行統計分析，各數據均以均數±標準差（s）表示，計量資料比較用單因素方差分析（one－way ANOVA），以 P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 雙側股骨骨密度及血清中ALP濃度比較

與輻射組比較，空白對照組、高劑量組、中劑量組骨密度及ALP濃度明顯增高（P<0.01，P<0.05）。與BM回輸組比較，高劑量組、低劑量組骨密度明顯增高（P<0.05），高劑量組ALP濃度明顯增高（P<0.05）。與低劑量組比較，高劑量組ALP濃度明顯增高（P<0.05）。結果見表1。

表1 小鼠雙側股骨單位體積骨量和血清中ALP濃度比較 （s）

表1 小鼠雙側股骨單位體積骨量和血清中ALP濃度比較 （s）

注：與輻照組比較，1）P<0.01，2）P<0.05；與 BM 回輸組比較，3）P<0.05；與低劑量組比較，4）P<0.05

3組別 n 單位體積骨量（g/cm）ALP（pg/mL）輻照組 8 6.01±2.33 1 380.9±180 BM 回輸組 8 6.92±1.72 1 594.5±265低劑量組 8 7.00±1.78 1 619.4±207中劑量組 8 8.46±2.012）3）1 827.4±3431）高劑量組 8 9.05±1.711）3）1 886.2±3781）3）4）空白對照組 8 9.16±2.281）1 997.9±2251）

2.2 股骨組織病理學觀察結果

輻照組：輻照后骨髓組織結構凌亂，骨髓單核細胞大量消失，部分組織變性，含有大量脂肪空泡，骨小梁稀疏甚至消失；BM回輸組：骨小梁較輻照組數量明顯增多，骨髓單核細胞數量明顯增多，但仍含有大量的變性組織；低劑量組：骨小梁增多增粗，小梁排列紊亂，骨髓單核細胞數量較輻照組明顯增多；中劑量組：骨小梁和骨髓細胞情況介于低劑量組和高劑量組之間；高劑量組：骨小梁排列有序堅實，骨髓單核細胞多，變性組織明顯減少，接近正常。空白對照組：骨小梁粗壯，排列有序，骨髓細胞數量多。

3 討論

IR可造成骨量丟失，骨密度下降，嚴重者可引起骨質疏松性骨折，在宇航員和腫瘤放療患者身上尤為突出。有臨床研究報道，骨盆腫瘤患者放療后，5年內髖骨和股骨頸骨折發生率增加超過65%［1］，乳腺癌患者接受放療后肋骨骨折發生率為1.8%［3］，最高可達19%［4］，給患者的身體和心理帶來了巨大負擔。另外，動物研究發現，小鼠接受2 Gy的電離輻射，117 d予Micro-CT檢測股骨和脛骨，骨小梁體積較對照組下降20%，骨小梁間隙增加11%，骨密度下降19%，表明電離輻射可導致小鼠骨量丟失，骨密度下降，脆性骨折發生率增高［5］。目前，IR導致骨量丟失，骨密度下降的機制尚不十分清楚。IR殺死骨髓細胞，包括成骨細胞、間充質干細胞等，抑制成骨細胞的增殖和成骨功能，破壞骨髓內環境，導致成骨形成低下是目前認可的觀點［6］。本實驗小鼠接受大劑量全身輻照后，破壞殺死骨髓細胞，抑制成骨細胞增殖和成骨功能，引起骨量丟失，導致骨質疏松癥。通過檢測小鼠雙側股骨骨密度情況，發現γ射線組顯著低于空白對照組，表明輻照導致小鼠骨量丟失模型已成功。

BMSC是一類具有自我更新和多向分化增殖潛能的原始骨髓細胞，其組成比較復雜，主要包括間質干細胞、造血干細胞和內皮祖細胞等［7］。其中骨髓間充質干細胞（MSC）易于分離擴增，在不同理化環境和細胞因子的誘導下，可定向地向成骨細胞方向分化，最終形成骨。早在 1995 年，Perira R F 等［8］利用動物實驗檢測MSC在體內的走向，證實MSC可以向多種造血以外組織遷移定位并分化為相應的組織細胞，成功地向成骨細胞分化。國內學者韓冬等［9］在體外礦化誘導兔MSC，將誘導后MSC-去抗原牛松質骨復合體植入裸鼠背部皮下。結果表明MSC向成骨細胞方向分化和增殖。大量實驗研究表明，骨髓間充干細胞的成骨分化功能，使其在治療骨量丟失、骨質疏松癥、骨折延遲愈合、骨折不愈合等疾病中具有巨大的潛力。隨著細胞工程學的發展，體外誘導MSC向成骨細胞分化也越來越成熟。在含有胎牛血清的低糖DMEM中加入地塞米松、β-甘油磷酸鈉、維生素C或堿性成纖維生長因子（b-FGF）和骨形態發生蛋白可以誘導MSC向成骨細胞分化。

對于成骨細胞的鑒別可以依靠成骨細胞的特異性分泌蛋白，如ALP、骨鈣素（OPG）和I型膠原蛋白等，以及體外礦化的功能特征。堿性磷酸酶活性被認為是成骨細胞的一個重要生物學標志。文獻報道，血清ALP與骨形成參數間為正相關關系，可作為監測和初步判斷成骨細胞活性的簡易指標之一［10］。在成骨細胞增殖晚期，分泌ALP與鈣鹽結晶體至細胞外基質中，ALP可使局部磷酸含量增高，促使基質礦化，能夠反映成骨細胞合成I型膠原、形成骨基質的能力［11］。因ALP是一種細胞外酶，可釋放到血液循環中，故可用來監測體內成骨細胞的增殖和活動情況。

右歸飲出自明代張介賓的《景岳全書》，作為溫補腎陽的代表方劑，《醫經精義》云“腎藏精，精生髓，髓生骨，故骨強”。說明骨為髓所主，骨的生長發育有賴于髓的濡養。若腎氣不足，腎精虧虛，骨髓失充，骨骼失養，則脆弱乏力。右歸飲具有溫補腎陽、益骨生髓的功效。在細胞研究中發現右歸飲具有促進骨髓基質細胞向成骨細胞分化、增殖，提高成骨細胞活性的作用。吳云剛等［2］將右歸飲含藥血清加入骨髓基質干細胞誘導分化成骨細胞的體外實驗研究中發現，右歸飲能促進骨髓基質干細胞向成骨細胞分化。

輻照可以破壞殺死骨髓細胞，造成小鼠股骨骨密度下降，骨量丟失。經過BM回輸，右歸飲灌胃治療后，小鼠雙側股骨骨密度較輻照組和BM回輸組顯著增加，血清ALP濃度升高，股骨組織病理發現骨小梁排列有序且堅實，骨髓單核細胞數量多，變性組織少，顯著優于輻照組。綜上所述，右歸飲可促進異體骨髓細胞向成骨細胞分化，改善輻照后骨量丟失情況。

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