正交試驗法優選消腫活血合劑的提取工藝

王瓊珺，高偉城

（漳州衛生職業學院，福建 漳州363000）

消腫活血合劑源于漳州市中醫院骨科的經驗處方，由當歸尾、赤芍、黃柏、陳皮、澤蘭、蒼術等10味中藥制成，具有活血化瘀、消腫止痛之功。該方用于治療跌打損傷和骨折初期所致的肢體腫脹、疼痛、瘀血等，臨床運用幾十年，療效確切。該方以當歸尾、赤芍為君藥，活血化瘀，配合黃柏、澤蘭、忍冬藤以清熱涼血、散瘀消腫，以防損傷初期瘀血化熱之證，共為臣藥；用人中白、兩面針、大丁癀托里定痛，祛瘀止血，為佐藥；以陳皮、蒼術為使藥，固衛脾胃，以免克伐之弊。為控制產品的質量，穩定制劑的工藝，給患者提供更加安全有效的口服制劑，本實驗采用正交試驗法對原制劑的提取工藝進行優化，為生產工藝的確立提供實驗依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 AgiLent 1200高效液相色譜（包括真空脫氣機、四元梯度泵、紫外檢測器、自動進樣器、Ver 08.01-Chemistation化學工作站）；電子天平 BP211D（1／100000 g），德國 Sartorius；電子天平 BSA4202S（0.01 g～4200 g），德國 Sartorius；電煎藥鍋，長沙市雨花區中誠制藥機械廠；R201B旋轉式蒸發儀，上海申生科級科技有限公司；KEJ-1000型超聲波清洗機，張家港科凈超聲洗凈設備有限公司。

1.2 試藥 赤芍、當歸尾、忍冬藤、兩面針、大丁癀、澤蘭、陳皮、黃柏、蒼術、人中白，經漳州衛生職業學院中藥教研室蔡揚帆副教授鑒定為合格藥材。芍藥苷對照品 （中國藥品生物制品檢定所，批號：110736-200732，純度 98.1%）、甲醇、乙腈（色譜純，美國TEDIA“天地”試劑公司）、超純水（艾柯超純水機）。

2 方法與結果

2.1 正交試驗設計 取消腫活血方（歸尾40 g，赤芍 64 g，兩面針 64 g，大丁癀 64 g，澤蘭 64 g，陳皮40 g，黃柏 32 g，蒼術 16.8 g，忍冬藤 64 g，人中白23.3 g）1／4 量藥材，以加水倍數（A）、提取時間（B）、提取次數（C）為考察因素，各因素設計3個水平，以芍藥苷含量、干浸膏得率及綜合評分為考察指標，按 L9（34）正交表安排試驗［1-2］。 因素水平見表 1。

2.2 水煎提取試驗 按處方量稱取9份樣品，按因素水平表和試驗表，進行水煎煮提取。每份加水后浸泡1 h，煎液濃縮至250 mL。

2.3 干浸膏得率測定方法 精密移取提取液25.00mL，置干燥至恒重的蒸發皿中，在水浴上蒸干后，于105℃真空干燥3 h，移至干燥器中，冷卻30 min，迅速精密稱定重量，計算，即得［3］。結果見表2。

表1 正交試驗因素水平表

表2 L9（34）水提取工藝正交試驗結果

干浸膏得率＝（干浸膏重／11.8）×100%

2.4 芍藥苷含量測定

2.4.1 色譜條件 色譜柱：zorbax SB C18柱（4.6 mm×150 mm，3.5 μm）；流動相：甲醇-0.05 moL／L磷酸二氫鉀（40∶60）；流速：1.0 mL／min；柱溫：35℃；檢測波長：230 nm；進樣量：15 μL。芍藥苷對照品、消腫活血合劑樣品和缺赤芍的陰性對照樣品的HPLC色譜圖，見圖1～圖3。

2.4.2 線性關系考察 精密稱取芍藥苷對照品14.07 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得每1 mL甲醇中含芍藥苷276.05 μg的對照品母液。分別精密吸取對照品母液1、2、3、4、5 mL至25 mL量瓶中，加甲醇制成不同濃度的對照品溶液。精密吸取15 μL，分別注入高效液相色譜儀中，按上述色譜條件進行測定。以對照品進樣濃度（μg／mL）為橫坐標X，相應峰面積為縱坐標Y，進行線性回歸，繪制標準曲線。芍藥苷回歸方程為：Y＝38.379X－25.571 （r＝0.9998）， 表明在11.042～55.210 μg／mL范圍內呈良好的線性關系。

圖1 芍藥苷對照品HPLC色譜圖

圖2 消腫活血合劑樣品HPLC色譜圖

圖3 陰性對照樣品（缺赤芍）HPLC色譜圖

采用的高效液相測定法方法驗證結果：空白試驗無干擾，加樣回收率平均為99.4%，RSD＝0.75%（n＝6），表明方法準確度良好；對照品溶液精密度0.31%（n＝6），表明儀器的精密度良好；供試品溶液穩定性試驗RSD為0.59%（n＝6），并且24 h基本穩定；重復性試驗RSD值為0.91%，表明該方法的重復性良好。

2.4.3 供試品溶液的制備與測定 取消腫活血合劑1 mL至25 mL量瓶，加甲醇溶解，超聲處理（250 W，40 kHz）30 min，取出，放冷，加甲醇至刻度，濾過，取續濾液，即得。精密吸取15 μL進樣，按標準曲線法計算芍藥苷的含量。結果見表2。

2.4.4 綜合評分 綜合得分［4］＝［（芍藥苷含量 ／最大值）×0.5＋（出膏率 ／最大值）×0.5］×100。

2.5 試驗結果與方差分析 見表3。結果表明，影響芍藥苷含量和干浸膏得率綜合指標最大的因素是煎煮次數，其次是加水量，最后是煎煮時間。由方差分析表3可知：煎煮次數和加水量有顯著性差異，提取時間無顯著性差異。最佳提取條件為：提取條件C3A2B2。即最佳條件為煎煮3次，每次煎煮1.5 h。結合直觀分析與實際生產，確定最佳水提取工藝為煎煮3次，加10倍量的水，每次1.5 h。

表3 試驗結果方差分析表

2.6 工藝驗證 結果3批樣品芍藥苷的含量分別為 885.21、884.62 和 884.35 μg／mL， 干浸膏得率分別為23.01%、22.98%和22.93%。表明正交試驗選出的工藝條件合理，工藝條件穩定可行。

3 討 論

3.1 當歸尾具有補血活血之功效，為本方的君藥。以含量測定指標成分代表性分析，當歸尾中的阿魏酸最為適宜。原試驗設計采用芍藥苷含量、阿魏酸含量、干浸膏得率三者綜合得分為指標。在測定歸尾中阿魏酸含量時，陰性對照有干擾。赤芍其主要成分為芍藥苷，具有解痙、鎮痛、鎮靜、抗炎、抗潰瘍等作用，亦為本方的君藥，其含量可作為工藝優選的主要依據之一。故實驗選用測定芍藥苷的含量及干浸膏得率為綜合指標考察水煎煮提取工藝。

3.2 《中華人民共和國藥典》2010年版［3］及相關文獻［1-2］中，芍藥苷的測定波長均為230 nm，故本實驗采用230 nm作為測定波長。

3.3 干浸膏得率對藥效與制劑工藝有一定的影響，故選擇總固體得率和處方中所含主要成分為提取工藝的綜合指標。

3.4 處方原總量 472.1 g，共制 1000 mL，服用劑量每次25 mL，每天3次。由于總量較大，故試驗時取1／4量，定量到 250 mL。

［1］趙慧萍.通脈合劑的制備及質量控制［J］.中藥材，2008，31（12）：1913-1914.

［2］王志萍，韋慧鮮，申文慧.腦血栓片中芍藥苷的定性定量測定［J］.時珍國醫國藥，2006，17（12）：2411-2412.

［3］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部［S］.北京：中國醫藥科技出版社，2010：96-97.

［4］王凌，徐玲玲，符德玉.丹蛭合劑提取工藝研究［J］.中成藥，2008，30（7）：1064-1065.