冬蟲夏草多糖肽的提取與制備

陳肖虹，黃宏南

（1.福建中醫藥大學附屬人民醫院，福建 福州 350004；2.福建省疾病預防控制中心，福建 福州 350001）

多糖肽是一種糖蛋白，是多糖與蛋白質的結合體。真菌多糖肽一般都具有抗腫瘤活性和提高免疫力的生物活性。國內期刊數據庫檢索發現，關于冬蟲夏草中蟲草素、蟲草酸、腺苷等成分的研究已十分普遍，然而關于蟲草多糖的研究報道主要集中在近十年且較少，而對蟲草多糖肽的研究則難覓蹤跡。因此，包含多糖肽在內的多糖類成分將是蟲草開發研究的一個重要突破口。本研究提出一種制備冬蟲夏草多糖肽（純度＞95%）的方法，可用于該類產品的測定，此項研究尚未見文獻記載。

1 研究背景

多糖肽引起醫藥界廣泛興趣源于1977年，日本吳羽化學（Kureha Chemicals）利用熱水萃取法和硫酸胺鹽析法純化出CM101品系云芝菌絲體的云芝糖肽［1］。1989 年楊 慶堯等［2-3］改用熱 水 浸取和 醇析法萃取出 Cov-1品系云芝菌絲體中的云芝糖肽（polysaccharide peptides，PSP）。近年來學者對真菌多糖肽的研究偏少，主要是從云芝、靈芝屬等中提取多糖肽。在提取與制備方法上，傳統的云芝糖肽多以干燥的菌絲體為材料，用鹽析法、水提醇沉法等提取制備，但這些方法所得產品都是粗制品，含有大量鞣質、蛋白質、脂肪等，須用層析法等進行條件優化得到純品。靈芝屬多糖肽，既有用子實體也有用菌絲為材料，同樣多采用熱水浸提和乙醇沉淀的方法制備［4-6］。 2007 年 Jung-Young 等［7-8］從蜂頭蟲草（Cordyceps sphecocephala）J-201菌絲深層發酵液中通過乙醇沉淀法提取出PSP。因此，本文采用乙醇沉淀法制備冬蟲夏草多糖肽，但由于不同真菌產生的多糖肽在量化性質上稍有差別，所以在具體提取工藝流程和條件上較之前研究有區別。

2 制備方案

在制備冬蟲夏草多糖肽之前，首先需要獲得含有高分子量的多糖肽溶液，本課題以冬蟲夏草純粉為原料的水提取液，將其濃縮、離心、透析、截留而獲得的含有高分子量的冬蟲夏草多糖肽。冬蟲夏草多糖肽溶液的工藝流程見圖1，得到冬蟲夏草多糖肽純品。本節給出的是通用的實施方式，其本質是乙醇沉淀法。

2.1 粗品制備 用濃度為1%的冬蟲夏草多糖肽溶液，在不斷攪拌中緩慢滴加無水乙醇至原體積的一半，即 1∶0.5（V／V），置冰箱過夜，離心（10000～12000 r／min），用無水乙醇分級沉淀，收集 33%乙醇沉淀部分，置冰箱，真空干燥得第1級成分為冬蟲夏草多糖肽I。取上清液再滴加無水乙醇至1∶1（V／V），置冰箱過夜，離心（10000～12000 r／min），用無水乙醇分級沉淀，收集33%～50%的沉淀，置冰箱真空干燥得第2級成分為冬蟲夏草多糖肽Ⅱ。將上清液繼續加乙醇至 1∶1.5（V／V），得第 3級成分冬蟲夏草多糖肽Ⅲ，置真空低溫干燥得冬蟲夏草多糖肽粗品。

2.2 純品制備 取冬蟲夏草多糖肽Ⅲ （冬蟲夏草多糖肽粗品）以1∶10比例加水微熱溶解，離心去雜，通過聚丙烯胺凝膠Bio-Gel系列多次柱分離，用含50 mol／L NaCl的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液（pH＝5.8～6.0，0.2 mol／L），透析 12～20 h，取袋內液濃縮，用3倍無水乙醇沉淀，離心，收集沉淀部分，冷凍干燥，得淺褐色粉末狀物質為冬蟲夏草多糖肽。

3 制備和HPLC法測定

3.1 制備實例 為驗證本文提出的制備工藝，本文借助福建省疾病預防控制中心理化實驗室實施了多次實驗，本節給出一個實施案例如下。

3.1.1 實施步驟1 用濃度為1%的冬蟲夏草多糖肽溶液，在不斷攪拌中緩慢滴加無水乙醇至1∶0.5（V／V），置冰箱過夜，用 11000 r／min 離心，用無水乙醇分級沉淀，收集33%乙醇沉淀部分，置冰箱真空干燥得冬蟲夏草多糖肽I。

3.1.2 實施步驟2 取“3.1.1”項中沉淀后上清液滴加無水乙醇至1∶1（V／V），同上處理后收集33%～50%的沉淀，置冰箱真空干燥得冬蟲夏草多糖肽Ⅱ。

3.1.3 實施步驟3 將“3.1.2”項沉淀后上清液再加乙醇至 1∶1.5（V／V），得冬蟲夏草多糖肽Ⅲ，置真空低溫干燥即得冬蟲夏草多糖肽粗品。

3.1.4 實施步驟4 取“3.1.3”項所得冬蟲夏草多糖肽粗品以1∶10比例加水微熱溶解，用11000 r／min離心去雜，通過聚丙烯胺凝膠Bio-Gel系列多次柱分離，用含50 mol／L NaCl的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液（pH＝5.9，0.2 mol／L），透析 16 h，取袋內液濃縮，用3倍無水乙醇沉淀，離心，收集沉淀部分，冷凍干燥，得淺褐色粉末狀物質為冬蟲夏草多糖肽純品。

3.2 HPLC法測定

3.2.1 測定方法及條件 采用HPLC-PDA法測定。主要儀器為：Waters e2695型高效液相色譜儀系統，Waters e2996型二極管陣列檢測器，Empower色譜工作站及數據處理系統；Beckman Coultcr高速離心機；MILLIPORE direct-Q純水系統。色譜條件為色譜柱：Atlantis T3柱 （4.6×250 mm，5 μm）；柱溫：35℃；流動相：體積分數為5%的甲醇水溶液，流速為 1.0 mL／min，進樣量為 10 μL；檢測器為二極管陣列檢測器，掃描波長為190～460 nm。對照所用標準品采用的是國家菌草工程技術研究中心的冬蟲夏草多糖肽標準品，純度＞98%。

3.2.2 測定結果 取上述實施案例制備的冬蟲夏草多糖肽純品，經前處理后用HPLC-PDA檢測并與標準品對照，結果顯示為冬蟲夏草多糖肽單峰（見圖2和圖3），無糖峰和肽峰分開出現的現象。此外，在掃描波長190～460 nm范圍內，制備的冬蟲夏草多糖肽純品的最大吸收波長為192.3 nm，這也與標準品的最大吸收波長192.3 nm相同，雙重定性可以確定制備所得確是冬蟲夏草多糖肽。并經多次實驗驗證，利用本文所述的制備工藝所得冬蟲夏草多糖肽純度均在95%以上，因而可在測定冬蟲夏草產品質量檢測應用中用作對照品。

圖2 冬蟲夏草多糖肽標準品的色譜圖

圖3 冬蟲夏草多糖肽純品的色譜圖

4 結 語

本文提出了一種制備冬蟲夏草多糖肽的方法，此項研究國內尚未見報道。制備實驗和HPLC測定結果顯示，利用本文所述方法可以制備冬蟲夏草多糖肽，且純度＞95%，可用于冬蟲夏草多糖肽制品如保健品的測定。

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