腎陽(yáng)虛、腎陰虛證大鼠模型的建立與穩(wěn)定性觀(guān)察

張子怡，陳寶軍，張英杰，王雯婷，王藝茹，蘇友新

（福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建 福州 350122）

中醫(yī)證候動(dòng)物模型的建立與研究是連接中醫(yī)基礎(chǔ)和臨床的樞紐，是深化對(duì)證候?qū)嵸|(zhì)認(rèn)識(shí)的重要方法之一，同時(shí)也是篩選有效中藥、藥物作用機(jī)制深入研究的關(guān)鍵手段之一。所以，尋找既符合中醫(yī)學(xué)理論，又真實(shí)反映臨床證候特征，且具有較好穩(wěn)定性和重復(fù)性的動(dòng)物模型以滿(mǎn)足中醫(yī)藥研究的需求，是中醫(yī)證候動(dòng)物模型研究的重要任務(wù)［1］。大量外源性腎上腺皮質(zhì)激素的補(bǔ)充可抑制體內(nèi)促腎上腺皮質(zhì)激素的釋放，進(jìn)而反饋使得內(nèi)源性類(lèi)固醇激素分泌減少，當(dāng)停止外源腎上腺皮質(zhì)激素補(bǔ)充時(shí)，會(huì)出現(xiàn)一系列與臨床腎陽(yáng)虛證候患者類(lèi)似的癥狀、體征；而利用甲狀腺素可提高動(dòng)物的基礎(chǔ)代謝率，引起全身性因代謝影響而出現(xiàn)與腎陰虛證候相似的表現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)在前人研究的基礎(chǔ)上，選擇較為經(jīng)典且應(yīng)用最多的肌注氫化可的松及灌胃甲狀腺片的方法分別復(fù)制腎陽(yáng)虛、腎陰虛證候大鼠模型，并在造模結(jié)束后繼續(xù)觀(guān)察3周，以獲得既符合腎陽(yáng)虛、腎陰虛證候特征，又具有較穩(wěn)定表現(xiàn)的、簡(jiǎn)便可行的動(dòng)物模型，為中醫(yī)腎陽(yáng)虛、腎陰虛證本質(zhì)的研究提供可靠、穩(wěn)定的證候動(dòng)物模型。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組 健康3月齡SPF級(jí)WISTAR大鼠 90 只，均為雄性，體質(zhì)量（210±20）g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（滬）2012-0002，質(zhì)量合格證編號(hào)：2007000548015。采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為3組，即正常組、腎陽(yáng)虛組及腎陰虛組各30只。

1.2 試劑及藥物 大鼠環(huán)磷酸腺苷（cAMP）及大鼠環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷（cGMP）ELISA試劑盒（上海Westang Bio-tech有限公司）；甲狀腺片（山東省萊陽(yáng)生物化學(xué)制藥廠(chǎng)，國(guó)藥準(zhǔn)字：H37020075，產(chǎn)品批號(hào)：110805）；氫化可的松注射液 （福州海王福藥制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字：H35020193，產(chǎn)品批號(hào)：1209111）。

1.3 主要儀器 電子體溫計(jì)（FT-A21CN型，深圳市貝利斯科技發(fā)展有限公司）；酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（ELX808型，美國(guó)BIO-TEK）；電子天平（YP202N型，上海精密科學(xué)儀器有限公司）；離心機(jī)（64R型，美國(guó)BECKMAN公司）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 甲狀腺片混懸液的制備 將甲狀腺片置研磨器中研磨成粉末，然后用無(wú)菌生理鹽水溶解混勻，制成40 mg／mL的甲狀腺片混懸液，4℃冰箱保存，使用前搖勻。

1.4.2 模型造模方法

1.4.2.1 腎陽(yáng)虛證大鼠模型 臀部肌肉注射氫化可的松注射液（2.5 mg／100 g），每日 1 次，自由飲水、飲食，連續(xù) 15 d［2］。

1.4.2.2 腎陰虛證大鼠模型 灌胃甲狀腺片混懸液（45 mg／100 g），每日 1 次，自由飲水、飲食，連續(xù)15 d［3］。

1.4.3 模型鑒定方法

1.4.3.1 大鼠血清cAMP、cGMP含量的檢測(cè) ①造模結(jié)束時(shí)首次檢測(cè)：取正常組、腎陽(yáng)虛組、腎陰虛組大鼠，吸入乙醚麻醉后，用左手拇指及食指輕輕壓迫動(dòng)物的頸部?jī)蓚?cè)，使眶后靜脈叢充血、眼球充分外突，右手持毛細(xì)玻璃采血管進(jìn)行眼眶后靜脈叢采血 1～1.5 mL。 4℃冰箱放置 4 h后，2000 r／min離心10 min取上清，使用cAMP和cGMP ELISA試劑盒檢測(cè)大鼠血清中cAMP、cGMP含量，具體步驟參考cAMP和cGMP ELISA試劑盒操作說(shuō)明書(shū)。②造模結(jié)束后3周再次檢測(cè)：取正常組、腎陽(yáng)虛組、腎陰虛組大鼠，用10%水合氯醛以300 mg／kg的劑量腹腔注射麻醉大鼠，常規(guī)備皮，取腹部正中入路打開(kāi)腹腔，抽取腹主動(dòng)脈血液。血液標(biāo)本處理及檢測(cè)方法同“造模結(jié)束時(shí)首次檢測(cè)”。

1.4.3.2 大鼠體重及體溫的檢測(cè) 于造模首日、造模結(jié)束時(shí)及造模結(jié)束3周后的上午9點(diǎn)，分別測(cè)定3組大鼠的體重、體溫。① 體重檢測(cè)：將大鼠逐一放在電子天平上測(cè)量體重并記錄。② 體溫檢測(cè)：待大鼠排便完全后，左手固定大鼠，右手將電子體溫計(jì)蘸上甘油后緩慢插入肛門(mén)，至電子體溫計(jì)發(fā)出體溫穩(wěn)定提示音即可，讀取體溫并記錄。

1.4.3.3 腎陽(yáng)虛證大鼠模型 ① 一般狀態(tài)［2，4］：與正常組大鼠比較，模型大鼠出現(xiàn)體重增長(zhǎng)緩慢且低于腎陰虛組大鼠，體溫下降，活動(dòng)減少，反應(yīng)遲鈍，蜷縮弓背，畏寒怕冷，體毛枯疏并失去光澤等陽(yáng)虛的表現(xiàn)。②環(huán)核苷酸系統(tǒng)的變化：與正常組大鼠比較，模型大鼠血清cGMP含量上升，cAMP含量下降，cAMP ／cGMP 比值降低［4］。

1.4.3.4 腎陰虛證大鼠模型 ① 一般狀態(tài)［5］：與正常組大鼠比較，模型大鼠出現(xiàn)躁動(dòng)、易驚、怕人等表現(xiàn)，體重增長(zhǎng)較正常組大鼠緩慢。② 環(huán)核苷酸系統(tǒng)的變化：與正常組大鼠比較，模型大鼠血清cAMP含量上升，cAMP ／cGMP 比值升高［4］。

1.4.4 大鼠模型穩(wěn)定性觀(guān)察 造模結(jié)束后，正常飼養(yǎng)大鼠，繼續(xù)觀(guān)察3周，通過(guò)肉眼觀(guān)察大鼠活動(dòng)、反應(yīng)及弓背情況，毛發(fā)、爪甲顏色變化等方面，并測(cè)量大鼠體重與體溫（肛溫），比較造模結(jié)束時(shí)和造模結(jié)束后3周所檢測(cè)大鼠血清cAMP、cGMP的含量，判斷腎陽(yáng)虛、腎陰虛模型大鼠表現(xiàn)的穩(wěn)定性。

1.4.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所得數(shù)據(jù)用（±s）表示。組內(nèi)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)和秩和檢驗(yàn)，組間比較采用單因素方差分析和LSD檢驗(yàn)。P＜0.05有顯著性差異。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠一般狀態(tài)的觀(guān)察與比較 造模后，與正常組大鼠比較，腎陽(yáng)虛組大鼠出現(xiàn)爪甲與耳朵顏色變淡；腎陰虛組大鼠爪甲與耳朵顏色無(wú)明顯變化，見(jiàn)圖1。造模后，與正常組大鼠比較，腎陽(yáng)虛組大鼠出現(xiàn)活動(dòng)減少、反應(yīng)遲鈍、弓背蜷縮、喜扎堆等畏寒怕冷表現(xiàn)；腎陰虛組大鼠出現(xiàn)躁動(dòng)、易驚、怕人等表現(xiàn)，見(jiàn)圖2。

圖1 3組大鼠爪甲與耳朵顏色變化情況比較

圖2 3組大鼠活動(dòng)及弓背等情況比較

2.2 3組大鼠體重比較 見(jiàn)表1。

表1 3組大鼠體重比較（±s）g

表1 3組大鼠體重比較（±s）g

注：與造模前比較，1） P＜0.01；與造模結(jié)束時(shí)比較，2） P＜0.01；與正常組比較，3） P＜0.01；與腎陰虛組比較，4） P＜0.05，5）P＜0.01。

組別正常組腎陽(yáng)虛組腎陰虛組n 302730造模前254.10±14.69253.93±15.50250.57±15.88造模結(jié)束時(shí)305.67±18.351）267.48±15.531）3）4）277.03±13.501）3）造模結(jié)束后3周371.90±18.561）2）290.63±14.591）2）3）5）312.26±20.751）2）3）

2.3 3組大鼠體溫比較 見(jiàn)表2。

表2 3組大鼠體溫（肛溫）比較（±s） ℃

表2 3組大鼠體溫（肛溫）比較（±s） ℃

注：與正常組比較，1） P＜0.01，2） P＜0.05；與腎陰虛組比較，3） P＜0.01；與造模前比較，4） P＜0.01。

組別正常組腎陽(yáng)虛組腎陰虛組n 302730造模前38.12±0.3038.11±0.3938.12±0.24造模結(jié)束時(shí)38.13±0.3337.17±0.371）3）4）38.33±0.252）4）造模結(jié)束后3周38.13±0.3437.33±0.311）3）4）38.34±0.232）4）

2.43組大鼠血清cAMP、cGMP含量比較 見(jiàn)表3。

3 討 論

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究是當(dāng)代醫(yī)藥學(xué)研究的重要方式。無(wú)論是基礎(chǔ)研究還是應(yīng)用研究，動(dòng)物模型已經(jīng)成為研究的一種重要工具［6］。借助于腎陽(yáng)虛、腎陰虛證動(dòng)物模型探討腎虛證實(shí)質(zhì)是一種可行的研究思路，是中醫(yī)證候?qū)嵸|(zhì)研究的重要手段之一。腎陽(yáng)虛造模方法多樣［7-9］，主要包括有如氫化可的松、腺嘌呤、羥基脲及抗甲狀腺等藥物造模，切除睪丸、腎上腺及甲狀腺等手術(shù)造模和根據(jù)中醫(yī)病因“恐傷腎”、房勞傷腎等三大類(lèi)造模方法。其中以氫化可的松造模法最為常見(jiàn)，模型在病理方面與腎陽(yáng)虛證實(shí)質(zhì)基本一致，其癥狀、體征也較符合腎陽(yáng)虛證的臨床表現(xiàn)。相較于手術(shù)模型，此法對(duì)于動(dòng)物創(chuàng)傷小，不會(huì)造成不可逆性傷害，方便后續(xù)研究；與根據(jù)中醫(yī)病因制作的模型比較，氫化可的松造模操作簡(jiǎn)便，可控性高，可重復(fù)性好。所以我們選取注射氫化可的松制作腎陽(yáng)虛動(dòng)物模型。腎陰虛造模方法包括有灌服甲狀腺素，注射過(guò)量的促腎上腺皮質(zhì)激素，采用手術(shù)結(jié)扎一側(cè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腎動(dòng)脈，服用大劑量熱性中藥如附子、肉桂等［10-11］。基于臨床上甲狀腺功能亢進(jìn)患者日久多數(shù)出現(xiàn)腎陰虛證候，故灌服甲狀腺素可通過(guò)升高外源性甲狀腺素水平從而復(fù)制腎陰虛動(dòng)物模型，且此造模方法已被廣泛采用。注射過(guò)量促腎上腺皮質(zhì)激素雖可使動(dòng)物出現(xiàn)一系列陰虛癥狀，但突然停用又可出現(xiàn)陽(yáng)虛表現(xiàn)；手術(shù)結(jié)扎腎動(dòng)脈法則對(duì)動(dòng)物會(huì)造成一定創(chuàng)傷，模型與預(yù)模擬的臨床病理表現(xiàn)有一定差距；而服用熱性中藥造模法在實(shí)驗(yàn)研究中較少應(yīng)用。因此我們選擇灌服甲狀腺素方法復(fù)制腎陰虛證動(dòng)物模型［12］。

表3 3組大鼠 cAMP、cGMP 含量比較（±s）

表3 3組大鼠 cAMP、cGMP 含量比較（±s）

注：與正常組比較，1） P＜0.01。

組別正常組腎陽(yáng)虛組腎陰虛組n 302730 cAMP／（pmol／mL）36.14±5.0923.17±4.801）75.50±6.521）造模結(jié)束時(shí)cGMP／（pmol／mL）8.80±3.4626.56±3.171）8.86±3.25 cAMP／cGMP 4.69±1.700.88±0.201）9.69±3.431）造模結(jié)束后3周cAMP ／（pmol／mL）36.95±3.8123.64±2.951）74.46±4.421）cGMP／（pmol／mL）8.06±0.9626.16±2.741）8.00±1.16 cAMP／cGMP 4.66±0.780.92±0.171）9.51±1.561）

目前關(guān)于腎陽(yáng)虛、腎陰虛證動(dòng)物模型的鑒定方法眾多，還沒(méi)有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)臨床腎虛證患者的表現(xiàn)，研究中動(dòng)物模型的癥狀與體征，如體溫、體重、毛色、弓背、活動(dòng)情況、采食量及飲水量等，常被作為腎陽(yáng)虛、腎陰虛的判斷指標(biāo)之一［13］，因?yàn)槟I陽(yáng)為人體陽(yáng)氣之根本，又被稱(chēng)為命門(mén)之火，是人體生命活動(dòng)的原動(dòng)力，具有蒸騰、推動(dòng)、溫煦及固攝等生理功能，能夠促進(jìn)機(jī)體新陳代謝，增強(qiáng)臟腑組織器官的功能活動(dòng)，制約體內(nèi)陰寒之氣等，故當(dāng)機(jī)體腎陽(yáng)虛弱時(shí)往往表現(xiàn)出新陳代謝緩慢、組織器官功能減弱以及體內(nèi)寒涼之象；腎陰為全身陰液之根本，具有滋潤(rùn)及制約陽(yáng)熱等生理功能，故當(dāng)腎陰虧虛時(shí)往往表現(xiàn)出一派陰虛火旺之象。另外，有關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)也是作為鑒定腎虛證模型的條件，其中cAMP、cGMP含量的檢測(cè)及cAMP／cGMP比值的計(jì)算是目前最常用的腎陽(yáng)虛、腎陰虛證動(dòng)物模型可量化鑒定方法之一。王培源等［14］經(jīng)過(guò)多年研究，結(jié)果顯示測(cè)定血漿cAMP、cGMP含量及其比值，可以作為幫助判斷腎陰虛、腎陽(yáng)虛的一個(gè)客觀(guān)指標(biāo)。美國(guó)生物學(xué)家Goldberg在上世紀(jì)70年代初曾提出細(xì)胞功能調(diào)節(jié)的“陰陽(yáng)學(xué)說(shuō)”，認(rèn)為cAMP與cGMP拮抗性作用與中醫(yī)的“陰陽(yáng)”相類(lèi)似。因此，本實(shí)驗(yàn)采用觀(guān)察模型動(dòng)物的相關(guān)狀態(tài)及檢測(cè)cAMP、cGMP含量和計(jì)算cAMP／cGMP比值作為腎陽(yáng)虛、腎陰虛證動(dòng)物模型的鑒定方法是可行的。

本實(shí)驗(yàn)觀(guān)察到腎陽(yáng)虛組大鼠造模后出現(xiàn)活動(dòng)減少，反應(yīng)遲鈍，體毛枯疏并失去光澤，爪甲與耳朵顏色變淡，弓背蜷縮，喜扎堆等畏寒怕冷表現(xiàn)，提示大鼠體內(nèi)新陳代謝減慢、組織器官功能減弱且體內(nèi)一派寒涼之象，其表現(xiàn)與臨床腎陽(yáng)虛證患者類(lèi)似；腎陰虛組大鼠出現(xiàn)躁動(dòng)、易驚、怕人等表現(xiàn)，提示大鼠的狀態(tài)表現(xiàn)與臨床腎陰虛證患者的陰虛火旺之象類(lèi)似。與正常組大鼠比較，腎陽(yáng)虛和腎陰虛組大鼠體重均低于正常組（P＜0.01），腎陽(yáng)虛組大鼠體溫顯著下降（P＜0.01），腎陰虛組大鼠體溫升高（P＜0.05）。通過(guò)檢測(cè)大鼠血清 cAMP、cGMP含量及cAMP／cGMP的比值計(jì)算結(jié)果顯示，腎陽(yáng)虛組大鼠cAMP含量下降 （P＜0.01），cGMP含量顯著升高及cAMP／cGMP 比值顯著降低（P＜0.01）；腎陰虛組大鼠血清cAMP含量及cAMP／cGMP比值均顯著升高（P＜0.01）。上述腎陽(yáng)虛、腎陰虛組大鼠的狀態(tài)表現(xiàn)與血清cAMP、cGMP含量檢測(cè)及cAMP／cGMP比值結(jié)果與茍小軍等［2］的研究結(jié)果是相符的，提示本實(shí)驗(yàn)?zāi)I陽(yáng)虛、腎陰虛證模型大鼠造模是成功的。造模結(jié)束后3周，發(fā)現(xiàn)腎陽(yáng)虛與腎陰虛組大鼠在活動(dòng)、反應(yīng)、毛色及體溫、體重等方面仍然具有較穩(wěn)定的表現(xiàn)，且大鼠血清cAMP、cGMP含量及cAMP／cGMP的比值計(jì)算結(jié)果仍提示本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型為腎陽(yáng)虛與腎陰虛證，說(shuō)明腎陽(yáng)虛、腎陰虛大鼠模型在造模后3周其證候表現(xiàn)依然穩(wěn)定。總之，本實(shí)驗(yàn)所建立的腎陽(yáng)虛證模型與腎陰虛證模型大鼠的癥狀、體征和血清cAMP、cGMP含量檢測(cè)及cAMP／cGMP比值結(jié)果均符合腎陽(yáng)虛、腎陰虛證模型的鑒定要求，造模結(jié)束后3周所記錄下的大鼠的癥狀、體征和血清cAMP、cGMP含量檢測(cè)及cAMP／cGMP比值結(jié)果均符合腎虛證模型的鑒定指標(biāo)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，注射氫化可的松和灌服甲狀腺素分別引起的大鼠相關(guān)癥狀、體征及環(huán)核苷酸系統(tǒng)的變化，分別與臨床腎陽(yáng)虛證、腎陰虛證的表現(xiàn)吻合，且造模結(jié)束后3周模型依舊保持穩(wěn)定，提示此法建立的腎陽(yáng)虛、腎陰虛證模型是確實(shí)可靠且相對(duì)穩(wěn)定的，說(shuō)明該方法是構(gòu)建腎陽(yáng)虛、腎陰虛證動(dòng)物模型的理想方法。

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