微波輔助酶法提取燕窩唾液酸及其益智功能性的研究

范群艷++陳昕露++連建梅++陳玲++張怡

摘 要 為優化燕窩唾液酸微波結合木瓜蛋白酶提取工藝，并研究燕窩對幼鼠學習記憶能力的影響。在單因素試驗的基礎上，選取微波處理時間，酶解溫度和pH三個因素進行響應面實驗設計，優化燕窩唾液酸的提取工藝；采用水迷宮試驗，測試燕窩對正常幼鼠學習記憶能力的改善作用。確定了燕窩唾液酸微波結合木瓜蛋白酶提取的最優工藝，工藝參數為微波時間100 s，酶解溫度60℃，pH 7，在此條件下唾液酸提取率為12.58%；水迷宮試驗表明，燕窩唾液酸提取液灌胃組幼鼠尋找平臺平均潛伏期均縮短，穿越平臺次數都增加。響應面法優化微波結合木瓜蛋白酶提取得到燕窩唾液酸的工藝，燕窩對幼鼠的學習記憶能力有一定的改善作用。

關鍵詞 燕窩 ；唾液酸 ；幼鼠 ；學習記憶能力

分類號 TS201.4 ；R284.I

Microwave-assisted Enzymatic Hydrolysis of Birds Nest Sialic Acid

and Its Effect on Improving Intelligence of Young Rats

FAN Qunyan1） CHEN Xinlu2） LIAN Jianmei1） CHEN Ling1） ZHANG Yi2）

（1 Xiamen Seelong Food CO. LTD， Xiamen， Fujian 361101；

2 College of Food Science， Fujian Agriculture and Forestry University，

Fuzhou， Fujian 350002， China）

Abstract The Optimized microwave-papain extraction of sialic in edible bird nest， and the effects of sialic on learning and memory in young rats were studied. On the basis of single factor experiment， the microwave processing time， enzyme temperature and pH were considered using response surface methodology； The stewed edible bird's nest and sialic acid standard group for the learning and memorizing ability of SD rats were observed by Morris water maze. It shown that microwave treatment could improve the hydrolysis rate， when the condition was microwave power 400W， microwave time 100 s， enzymolysis temperature 60℃， pH 7， the experimental sialic acid yield of （12.58±0.08）% was achieved. Through the water maze experiment， the test group rats could find the platform faster and more often， which indicated that certain dose of bird nest can enhance the abilities of learning and memory of young rats.

Keywords birds nest ； sialic acid ； young rats ； learning and memorizing abilities

燕窩是雨燕科（Apedidae）雨燕目中部分金絲燕分泌的唾液與其絨羽混合粘結所筑成的巢穴[1]。產于我國南部沿海一帶及越南、馬來西亞、印度尼西亞、泰國、緬甸等地。燕窩富含豐富的蛋白質、糖類和礦物質，其重要特征成分為唾液酸糖蛋白。唾液酸是一種神經氨酸的衍生物，廣泛存在于多種生物組織中。近年來研究發現，唾液酸及其衍生物在各種生命活動調節中起重要作用[2-5]。Morgan等[6]研究表明，隨著攝入唾液酸含量的增加，動物幼崽完成迷宮學習任務的能力提高，說明攝入外源唾液酸對動物幼崽發育起到重要作用。

木瓜蛋白酶提取燕窩中的唾液酸，能提高唾液酸的溶出量，提高提取率；但酶解反應所需的時間較長，速度較慢[7]。微波提取技術作為一種近年來較常用的技術，具有提取時間短、選擇性高、耗能低、提取條件溫和等優點[8-10]。因此本研究采用微波輔助酶法提取燕窩中唾液酸，分析各因素對燕窩唾液酸提取效果的影響，并通過響應面法優化其工藝參數，為燕窩唾液酸的綜合利用奠定基礎。同時以唾液酸純品和益于腦發育物質——腦復康為對照，研究燕窩唾液酸提取液對幼鼠學習記憶能力的影響，為功能性燕窩新產品的開發提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑

燕窩，原產地馬來西亞，廈門市絲濃食品有限公司提供；腦復康（吡拉西坦）片，購于天津金世制藥有限公司；唾液酸標準品，Sigma公司出品；其他試劑均為分析純；木瓜蛋白酶（酶活力為2.5×106 μ/g），北京化學試劑公司；實驗動物，昆明種幼鼠（清潔級），雄雌各半，體重10～12 g，由福建醫科大學實驗動物中心提供。

1.1.2 儀器endprint

PL602-L電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）、DHG-9053A型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海精宏實驗有限公司設備有限公司）、L530離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司）、C21-SH2126美的電磁爐（廣東美的生活電器制造有限公司）、MRO-DF6-H微波爐（日本日立電器有限公司）、DS-200型電動高速組織搗碎機（江蘇江陰市科研器械廠）、Morris水迷宮操作系統（深圳市瑞沃德生命科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 唾液酸提取工藝流程

燕窩粉末→酶處理→微波處理→滅酶→離心取上清液→燕窩唾液酸。

操作要點（1）燕窩粉末的制備：稱取一定量的燕窩，研磨過40目篩備用；（2）酶處理：稱取一定量燕窩粉末，按燕窩∶水（m/m）為1∶20的比例加入蒸餾水，加入4%木瓜蛋白酶（以燕窩粉末計），在一定的酶解溫度、時間和pH的條件下進行酶解。（3）微波處理：將酶解好的混合液在一定功率、時間下進行微波提取。（4）滅酶：將微波處理后的混合液在沸水浴中滅酶10 min。（5）離心：在3 000 r/min條件下離心10 min，取上清液即為燕窩唾液酸提取液。

1.2.2 唾液酸提取率

（1）標準曲線的制備[11]

稱取一定量的唾液酸標準品，分別配制成0、5、10、20、50、100、200 μg/mL標準唾液酸溶液，吸取1 mL，加入冰醋酸和酸性茚三酮試劑各1 mL，在沸水浴中煮沸保溫10 min，冷卻至室溫后，于470 nm波長處測定吸光值。以唾液酸濃度（C）為橫坐標，吸光度（A）為縱坐標，得標準曲線，A=0.005 1 C+0.020 4（R2=0.998）。

（2）提取率計算

取燕窩唾液酸提取液同1.2.1操作，通過標準曲線得到樣品中的唾液酸濃度，并計算提取率，計算公式為：

x=×100

式中，x：樣品中唾液酸提取率，%；

c：從標準曲線上查到的唾液酸濃度，μg/mL；

50：提取后定容體積，mL；

m：樣品的質量，g；

0.134 7：1 g標準燕窩中唾液酸的含量，g。

1.2.3 唾液酸提取液對幼鼠學習記憶能力的影響

（1）動物分組與給藥

SD幼鼠隨機分組，每組10只（雌雄各半）。設空白對照組（0.9%生理鹽水），唾液酸標準品組（0.50 mg/mL），燕窩唾液酸組（高70 mg/mL、中30 mg/mL、低10 mg/mL），腦復康組（225 mg/mL），每日灌胃量為0.2 mL，連續灌胃21 d，自由飲水和進食。

（2）水迷宮實驗[12]

末次給藥后，進行水迷宮行為測定。實驗的內容包括隱藏平臺獲得實驗、空間搜索實驗訓練。通過記錄與分析幼鼠平均找到逃避潛伏期、運動軌跡等，判斷幼鼠的學習和記憶能力是否提高。

平臺獲得實驗：實驗訓練5 d，每天4次，每次間隔5 min。以尋找水下平臺潛伏期（s）作為判斷幼鼠學習記憶能力的指標，如果幼鼠在1 min內找到平臺，讓其在平臺上停留10 s；如果未找到安全平臺，則將幼鼠引至安全平臺并在平臺停留10 s，逃避潛伏期記為60 s。

空間搜索實驗：5 d訓練結束后，在第6 天撤去安全平臺，將幼鼠釋放入水中，游泳60 s，測量60 s內幼鼠穿越原平臺放置處的次數。

1.2.4 數據統計分析

利用Design-Expert 8.0.6統計分析軟件進行數據處理。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 酶解溫度對唾液酸提取率的影響

在一定的酶解溫度條件下，pH為8，酶解2.5 h，燕窩唾液酸提取率均隨著酶解溫度的增大而先上升后下降，最適酶解溫度為55℃（圖1）。溫度對酶催化反應的影響由于其復雜性，還未完全清楚，一般來說，溫度是影響酶活性的主要原因，而溫度促使酶蛋白變性是可隨時間累加的[1]。

2.1.2 酶解時間對唾液酸提取率的影響

在酶解溫度為45℃，pH為8的條件下進行酶解。結果由圖2可知，燕窩經酶解2 h后，提取率達8.7%，之后唾液酸提取率趨于穩定。

2.1.3 pH對唾液酸提取率的影響

在酶解溫度為45℃，一定pH條件下酶解2.5 h，酶解最佳pH值均為7（圖3）。燕窩唾液酸提取率隨pH值的升高而升高，當pH值為7時最高，隨后下降。pH值影響酶催化速度，pH不同，酶及作用底物所帶電荷不同，酶的立體構象以及酶與底物的親和力不同，催化速度也就不同[14-15]。

2.1.4 微波功率和微波時間對唾液酸提取率的影響

通過均勻試驗研究微波功率及微波時間對燕窩唾液酸提取率的影響，由表1可知，微波功率400 W，微波時間60 s時，唾液酸提取率最高。這是因為微波功率越高、作用時間越長，則熱效應越明顯，而溫度高蛋白酶易失活。微波可以改善酶催化的反應體系，一方面可能改變了酶的活性中心立體結構，另一方面增加了底物與酶基團的接觸，從而提高酶催化反應速度[16]。

2.2 響應面試驗優化

選用Box-Benhnken實驗設計原理，選取微波處理時間（A）、酶解溫度（B）及pH值（C）3個影響因素，以唾液酸提取率為響應值Y，采用Design-Expert 8.0.6軟件對提取工藝進行響應面分析（表2），得到回歸方程：

Y=10.56+0.039×A+0.089×B-0.045×C-0.45×A×B-0.073×A×C-0.25×B×C-0.20×A2-0.20×B2-0.19×C2。endprint

由方差分析結果（表3）可知，微波處理時間、酶解溫度及pH在燕窩唾液酸的提取過程中有較顯著影響，失擬項不顯著，相關系數的平方R2=0.986 8。綜上所述，該模型可為分析和預測燕窩唾液酸的提取提供一個合適的模型。

以微波處理時間（A）、酶解溫度（B）及pH值（C）這3個影響提取率的因素兩兩組合為自變量，以燕窩唾液酸提取率為相應指標繪制響應面及等高線圖，用來評價各因素兩兩組合對提取率的交互影響作用，如圖4～6。

由等高線圖可以看出，酶解溫度、微波時間和pH兩兩交互作用極顯著。由響應面圖可以看出，當酶解溫度一定時，唾液酸提取率隨微波時間的延長表現出先上升后下降的趨勢。當pH一定時，唾液酸提取率隨微波時間的延長呈現出先上升后下降的趨勢，當pH一定時，唾液酸的提取率隨溫度的增高而增大，隨著pH的逐漸增加，唾液酸提取率呈現先上升后緩慢下降的趨勢。

響應面分析法得到燕窩唾液酸提取率最佳工藝條件為微波時間100.19 s，酶解溫度59.98℃，pH 6.95，預測提取率為12.61%。為了進一步證實該模型的模擬結果，在酶解溫度為60℃、pH為7.0的條件下微波處理100 s，平行提取3次，測得平均值為12.58%，預測值接近真實值，有很好的擬合性，進一步驗證了該模型的可靠性。

2.3 燕窩唾液酸提取液對改善幼鼠學習記憶能力的作用

Moms水迷宮試驗現是檢測動物記憶水平的重要工具，是Richard Morris在1981發明的。國內外學者將益智類藥食品灌胃大小鼠等，以水迷宮試驗評價是否有助于動物學習和記憶能力[17-19]。由表4可知，在定位航行實驗中，各個組別的幼鼠隨著尋找平臺試驗次數的增加，平均潛伏期都縮短，且燕窩唾液酸各劑量組幼鼠尋找平臺的平均潛伏期均比對照組短。其中，燕窩唾液酸中劑量組的平均潛伏期分別比燕窩低、高組短，略低于唾液酸標準品組，與腦復康的作用相當。觀察第6天的空間搜索實驗結果表明，相比于對照組，各試驗組穿越平臺次數均有所增加，燕窩唾液酸中劑量組在燕窩唾液酸組中穿越平臺次數中最高，次數略低于唾液酸標準品組和腦復康組。腦復康作為藥品在醫學中已有較深入的研究，研究證明其有抗老年癡呆、改善學習記憶功能的作用[20]。由此說明燕窩唾液酸提取液具有一定的改善小鼠學習記憶的功效。

3 結論與討論

采用響應面分析法優化了燕窩唾液酸的提取工藝，其最佳條件為：微波時間100 s，酶解溫度60℃，pH 7.0，該工藝條件下燕窩唾液酸的提取率為12.58%。

學習與記憶是動物和人類生存中重要的腦功能，人類區別動物的智力活動也是基于此。學習與記憶是一個復雜的研究領域，涉及多門學科，本試驗采用幼鼠進行動物試驗，初步證明了燕窩唾液酸提取液對于動物具有增長學習記憶能力的作用，但其影響機理需今后進一步研究。

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