皮膚結核診斷的新進展

白 潔，張全華，頡玉勝(綜述)，趙紅斌(審校)

(蘭州軍區蘭州總醫院安寧分院 a.檢驗科，b.皮膚美容科，蘭州730070)

據世界衛生組織統計，結核分枝桿菌(簡稱結核桿菌)每年引起全球約300萬人死亡［1］。隨著結核病呈流行性趨勢，皮膚結核(非肺性結核)也呈上升趨勢。不斷出現的耐藥結、耐多藥結核病，使有效控制結核病面臨更大的挑戰［2］。皮膚結核早期一般無癥狀，臨床表現多樣性，且與有些皮膚病表現相似，易造成誤診。實現對皮膚結核(非肺性結核)的有效診斷迫在眉睫。現皮膚結核桿菌的細菌學檢測和免疫學檢測，分子生物學檢測等方面進行綜述。

1 皮膚結核病的傳統診斷方法缺點

1.1 細菌學診斷 常規的細菌學診斷包括直接涂片抗酸染色和常規的細菌培養法。抗酸染色是最基本的檢測結核桿菌的方法［3］。由于皮膚標本中［活組織檢查(活檢)，膿液中］含菌量很小，所以陽性率很低。如果是非結核桿菌感染的皮膚結核則沒辦法檢測出結果。其次，細菌常規培養時間長，周期慢，要求高，通常需要2～3個月才能出結果而且培養出的結果陰性居多，從而影響結果的判讀。另外，與常規的結核桿菌細菌培養比［4］，非結核桿菌的檢測及鑒定通常操作要求更復雜。

1.2 免疫學診斷

1.2.1 結核菌素皮膚試驗 結核菌素皮膚試驗作為一項輔助診斷判斷機體是否感染結核桿菌，但此方法無法確定出是新感染的結核還是過去感染的結核桿菌，因此有一定的局限性［5-6］。

1.2.2 酶聯免疫吸附法 酶聯免疫吸附法可以檢測患者血清中結核特異性抗體，此方法無需特殊儀器而且能快速診斷出結核桿菌，所以在結核病血清學診斷方面研究最多也最廣［7-9］。近年來免疫層析法、蛋白印跡和免疫斑點法均對皮膚結核的診斷發揮重要的作用，尤其是免疫斑點法對皮膚結核的膿液、分泌物的檢測更為有效、快速。但觀察對象不同，檢測使用抗原不同，質量控制困難，人員操作等因素影響試驗結果［10］。

1.3 病理組織學檢查 結核桿菌皮膚感染常有典型的病理學特點，如朗格漢斯巨細胞，淋巴細胞為主形成的結核結節，中央有干酪樣壞死區域［10］。但由于非結核桿菌毒力較弱，中性粒細胞浸潤，嗜酸粒細胞增多，可發生非干酪壞死性組織細胞的反應，有的甚至不發生類上皮細胞反應［11］。另外，皮膚結核活檢的標本小，有些結核發生于面部，頸部不容易取材觀察。

2 新型皮膚結核診斷的方法

2.1 分子生物學診斷方法 近幾年，隨著分子生物學技術的飛速發展，結核桿菌分子分類鑒定方法也逐漸建立并完善起來。目前用于檢測皮膚結核的方法有聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)，核酸雜交，基因芯片等技術。

2.1.1 實時熒光定量PCR 實時熒光定量PCR檢測，具有高特異性、高敏感性、快速簡便等特點。結核桿菌易受物理、化學、藥物及免疫因素的影響而發生變異(細胞壁缺陷或稱L型菌、耐藥變異菌、持續菌或休眠菌等)，用傳統細菌學技術難以檢出，造成漏診和假陰性。PCR方法檢測對象是結核桿菌基因保守區段不受細胞表型和耐藥等因素的影響，可提高陽性的檢出率。丘疹壞死性結核用傳統方法通常在其皮損中查不到結核桿菌，文獻報道，在上述病例中丘疹壞死性結核疹中用PCR檢測到結核桿菌，這為皮膚結核的診斷提供可靠的依據［12］。熒光定量PCR是一種準確、快速、敏感性高、特異性好的方法，尤其對包埋的標本和組織蠟塊的檢測更為有效。弓顯鳳等［13］檢測15例臨床與病理上診斷為皮膚結核的石蠟包埋活檢標本，結果8例檢出結核桿菌復合群，比直接鏡檢與培養法所得的陽性率要高得多。李曉非等［14］應用實時熒光定量PCR法用于結核病診斷，其特異性和敏感性均有所提高，顯著高于涂片，且操作簡便，對于結核病尤其是肺外結核的診斷具有較高的應用價值。陳淑云和采云［15］報道用熒光定量PCR，敏感性要比一般PCR高，菌陽性尋常型狼瘡結核分泌物中陽性率為93.7%，在菌陰性尋常型狼瘡中為28.6%，而一般PCR在菌陰性的尋常型狼瘡中陽性率僅為24.8%。

2.1.2 核酸分子雜交 Posteraro等［16］將擴增的16SrRNA13種探針進行雜交，再與抗生蛋白鏈菌素-堿性磷酸酶共同孵育一段時間后加入相應底物，已雜交的產物即可顯色。用這種方法檢測從鏡檢及培養均為陰性的尋常狼瘡患者皮損中檢測到結核桿菌DNA，證實此技術的可靠性和更高的敏感性。

2.1.3 基因芯片技術 近年來，隨著分子生物學技術的飛速發展，基因芯片技術已初步應用于結核桿菌的實驗室診斷。基因芯片技術是針對不同的基因突變型，將核酸探針固定在載體上，同時用PCR技術進行特異性擴增，并將擴增片段與基因芯片進行雜交。最后芯片掃描成像，用配套軟件進行判讀，可以在6～8 h內得出鑒定結果，從而解決了傳統核酸印跡技術的操作繁瑣、自動化程度低、操作序列數量少、檢測效率低等缺點。張立群等［17］試驗的新型基因芯片技術，基因芯片集芯片技術與PCR技術為一體，具有較好的敏感性和特異性，而且芯片背景干凈清晰，可以快速檢測17種臨床常見分枝桿菌，將常規的檢測時間由6～8周縮短為6 h。與傳統方法相比，此法有效地解決了傳統基因芯片應用過程中，需要大型檢測設備不便于臨床應用推廣的瓶頸問題，但成本高［18］。

2.2 結核桿菌特異性細胞免疫反應檢測 結核桿菌特異性細胞免疫反應檢測作為新的體外細胞免疫檢測的手段，因其不受卡介苗接種后的交叉反應，以及不受絕大多數非結核桿菌的影響，主要用于結核的診斷［19］，其靈敏度和特異度可以達到90%以上;結核桿菌特異性細胞免疫反應檢測釋放試驗利用結核桿菌而非牛分枝桿菌BCG株系表達的抗原刺激外周血單核產生γ干擾素，用于結核桿菌潛伏感染或活動感染的輔助診斷，經體外全血培養，刺激全血標本中結核抗原特異性T細胞產生的免疫應答，從而提供一種結核桿菌感染T細胞檢測方法。檢測結果在血樣采集后12～18 h得出，報告結果分為陽性、陰性和不確定。與目前我國廣泛使用結核菌素皮膚試驗皮試比較，結核桿菌特異性細胞免疫反應檢測在發現結核菌感染的敏感性方面更有優勢，不僅如此，相比結核菌素皮膚試驗的診斷方面敏感性更高［20］。此外，由于結核桿菌特異性細胞免疫反應檢測不存在無法留取痰標本的問題，這對于一些無法留取痰標本的患者，尤其是肺外結核的輔助診斷具有較重要的實踐意義。

世界上1/3的人口都存在潛伏性結核桿菌的感染［21］。近年來，大量實驗結果表明結核桿菌特異性細胞免疫反應檢測與結核菌素皮膚試驗相比較，結核桿菌特異性細胞免疫反應檢測具有較高的特異性。對于潛伏感染結核桿菌特異性細胞免疫反應檢測的特異度在90%以上，結核桿菌特異性細胞免疫反應檢測對于判斷皮膚結核是否存在結核潛伏感染的結果比結核菌素皮膚試驗更準確［22-23］。

3 結語

運用新型、高效的技術及合理的診斷方案來診斷皮膚結核，成為皮膚結核病研究的主要課題。對皮膚結核診斷的新方案還有待于進一步研究。在診斷與治療皮膚結核桿菌感染時把傳統方法與分子分類鑒定方法相結合，綜合考慮各種檢測結果，可為皮膚結核桿菌感染的早期診斷與治療提供可靠依據。

［1］Dupnik KM，Martins MM，Souza AT，et al.Nodular secondary syphilis simulating lepromatous leprosy［J］.Lepr Rev，2012，83(4):389-393.

［2］王宇.全國第五次結核病流行病學抽樣調查資料匯編［M］.北京:軍事醫學科學出版社，2011:1-6.

［3］趙雁林，尚美.我國結核病實驗室診斷的現狀［J］.中華檢驗醫學雜志，2007，30(7):725-728.

［4］陳中秀，謝清波，周風榮，等.聚集沉淀涂片與直接涂片抗酸染色法檢測抗酸桿菌的應用比較［J］.中國防癆雜志，2009，31(4):225-226.

［5］Bechara C，Macheras E，Heym B，et al.Mycobacterium abscessus Skin infection after tattooing:first case report and review of the literature［J］.Dermatology，2010，221(1):1-4.

［6］林培歆，甘朝陽.血清結核抗體檢測和PPD試驗在結核病診斷中的應用［J］.海南醫學，2011，22(12):133-135.

［7］吳士及，陳家逸，黃勁，等.5種結核桿菌抗體檢測試劑對肺結核的診斷效能評價［J］.國際檢驗醫學雜志，2013，34(2):217-219.

［8］Das BK，Urquhart K，Ellis AE，et al.Induction of Mx protein in Atlantic cod with poly I:C:immuno-cross reactive studies of antibodies to Atlantic salmon Mx with Atlantic cod［J］.Fish Shellfish Immunol，2008 25(3):321-324.

［9］Shamshirband S，Hessam S，Javidnia H，et al.Tuberculosis disease diagnosis using artificial immune recognition system［J］.Int J Med Sci，2013，11(5):508-514.

［10］Paige C，Bishai WR.Penitentiary or penthouse condo:the tuberculous granuloma from the microbe's point of view［J］.Cell Microbiol，2010，12(3):301-309.

［11］Baselga E，Margall N，Barnadas MA，et al.Detection of Mycobacterium tuberculosis DNA in lobular granulomatous panniculitis(erythema induratum-nodular vasculitis)［J］.Arch Dermatol，2007，133(4):457-462.

［12］Winek J，Demkow U，Rowińska-Zakrzewska E，et al.Comparison of Th1 and Th2 response in the blood of tuberculous patients and healthy contacts［J］.Pneumonol Alergol Pol，2009，77(5):446-452.

［13］弓顯鳳，孫惠平，任郭俠，等.PCR技術在結核病診斷中的價值［J］.臨床肺科雜志，2008，13(9):1155-1156.

［14］李曉非，李冬玲，施巧霞，等.三種檢測方法對結核病診斷價值的比較研究［J］.實用醫技雜志，2008，15(4):451-452.

［15］陳淑云，采云.不同實時熒光定量聚合酶鏈反應技術研究進展［J］.國際檢驗醫學雜志，2012，33(5):558-560.

［16］Posteraro B，Sanguinetti M，Garcovich A，et al.Polymerase chain reaction-reverse cross-blot hybridization assay in the diagnosis of sporotrichoid Mycobacterium marinum infection［J］.Br J Dermatol，1998，139(5):872-876.

［17］張立群，王云霞，周敏，等.4種不同結核分枝桿菌檢測方法對結核病的診斷價值比較［J］.中華醫院感染學雜志，2010，20(11):1633-1635.

［18］Radomski N，Kreitmann L，McIntosh F，et al.The critical role of DNA extraction for detection of mycobacteria in tissues［J］.PLoS One，2013，8(10):e78749.

［19］Liu KT，Su WJ，Perng RP.Clinical utility of polymerase chain reaction for diagnosis of smear-negative pleural tuberculosis［J］.J Chin Med Assoc，2007，70(4):148-151.

［20］熊勇超，侯月云，趙建忠，等.γ干擾素釋放試驗在檢測結核分枝桿菌潛伏感染中的應用［J］.中國防癆雜志，2012，34(9):613-616.

［21］劉旭暉，樂軍，張忠順，等.γ-干擾素釋放試驗(IGRA)的診斷價值探討(高感染率背景下的研究結果)［J］.中國防癆雜志，2010，32(12):801-805.

［22］Liebeschuetz S，Bamber S，Ewer K，et al.Diagnosis of tuberculosis in South African children with a T-cell-based assay:a prospective cohort study［J］.Lancet，2011，364(9452):2196-2203.

［23］Kang YA，Lee HW，Yoon HI，et al.Discrepancy between the tuberculin skin test and the whole-blood interferon gamma assay for the diagnosis of latent tuberculosis infection in an intermediate tuberculosis-burden country［J］.JAMA，2012，293(22):2756-2761.