梅毒螺旋體傳代接種對兔梅毒模型RPR滴度的影響

于瑞星 尹躍平韓 燕 鐘銘英 施美琴 王 琪 龔匡隆

梅毒螺旋體傳代接種對兔梅毒模型RPR滴度的影響

于瑞星 尹躍平?韓 燕 鐘銘英 施美琴 王 琪 龔匡隆

目的: 明確兔睪丸組織中Tp Nichols菌株傳代接種對實驗兔血清學滴度的影響。方法:按照接種Tp菌株代數的不同，將23只家兔分為原代組(5只)、一代組(9只)、二代組(8只)，空白對照組(1只)。原代組所接種菌株為保存于液氮的Tp Nichols復蘇菌株；一代組實驗兔所接種菌株來自于原代組實驗兔腫大睪丸；二代組實驗兔所接種菌株來自于一代組實驗兔腫大睪丸。接種14天后抽取兔耳緣靜脈血并空氣注射致死，對兔的耳緣靜脈血清進行RPR和TPPA檢測。結果: 接種后實驗兔全部感染。原代組、一代、二代組RPR滴度≥1∶16的兔比例分別為20%，88.9%，100%，原代組與一代、二代組比較差異均有統計學意義(P＝0.008；P＝0.001)，一代組與二代組比較，差異無統計學差異(P＝0.249)。RPR幾何平均滴度在原代組、一代組、二代組分別為4.0，25.4，76.1，原代組與一代組、二代組間比較，差異有統計學差異(P＜0.05)，一代與二代組間比較差異無統計學差異(P＞0.05)。結論:在建立梅毒兔實驗模型時，將液氮中保存的Tp Nichols菌株在睪丸組織中傳代接種，可提高實驗兔的梅毒血清學滴度。

梅毒螺旋體； 新西蘭雄兔； 感染模型

梅毒是最常見的性傳播疾病之一，據WHO估計全球每年新發梅毒患者約1060萬例，1梅毒發病人數居乙類傳染病的第三位。目前還沒有預防控制梅毒的疫苗，有效的抗生素治療是預防控制梅毒的重要措施之一。青霉素是治療梅毒的一線藥物，但據報道一般人群青霉素過敏率為8%～28.1%。2，3頭孢曲松是治療梅毒的替代方案之一，但是目前有關頭孢曲松治療梅毒的藥物動力學等研究尚未明確。建立標準的兔梅毒感染模型是研究頭孢曲松等藥物治療梅毒機制的重要前提。根據文獻報道，4在人體治療梅毒血清學滴度下降4個單位才能稱為治療有效，如果在兔感染模型中RPR滴度低于1∶16，則給予感染的兔梅毒注射頭孢曲松后，RPR滴度變化幅度較小，不易評價頭孢曲松藥治療梅毒的療效。本文的研究目的是觀

察通過接種14天后取睪丸中傳代培養的Tp Nichols菌株立即再次接種是否能夠提高實驗兔血清滴度抗體，為建立梅毒抗菌藥物的藥效評價模型奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 新西蘭雄兔購于江蘇省金陵種兔廠，Tp Nichols標準株(美國華盛頓大學過敏與傳染病實驗室惠贈)；無菌生理鹽水；RPR試劑購于上海科華生物工程股份有限公司，TPPA試劑購于珠海麗珠股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌懸液制備 將液氮中低溫保存的Nichols標準株在37℃的培養箱中復蘇1 h，置于裝有15 mL無菌生理鹽水的燒瓶中剪碎后靜置15 min，取一定量的菌懸液于載玻片上，蓋上蓋玻片，置于暗視野顯微鏡下計數，制備一定濃度的菌懸液(約含梅毒螺旋體107/m L)。

1.2.2 睪丸接種 按照接種Tp菌株代數的不同，將23只實驗兔分為原代組(5只)、一代組(9只)、二代組(8只)，健康對照組(1只)。原代組實驗兔所接種菌株為保存于液氮的Nichols復蘇菌株；一代組實驗兔所接種菌株來自于原代組實驗兔腫大睪丸；二代組實驗兔所接種菌株來自于一代組實驗兔腫大睪丸。具體步驟如下:取體重3.0～3.5 kg的新西蘭雄兔，將其固定在兔實驗臺上，擠壓腹部，使其睪丸通過腹壓膨脹，用無菌棉球消毒后，將2 mL菌懸液分別注射致兩側睪丸，14天后取實驗兔耳緣靜脈血并空氣注射致死。

1.2.3 菌株保存 將處死的實驗兔固定于實驗臺上，用酒精棉球消毒后靜置1～3 min待酒精揮發，切開筋膜取出睪丸，置于裝有15 mL無菌生理鹽水燒瓶中，剪碎睪丸后靜置5min，吸取少量菌懸液至載玻片，蓋上蓋玻片，在暗視野顯微鏡下觀察計數螺旋體，制備一定濃度的菌懸液(約含梅毒螺旋體107/mL)，將2 m L菌懸液注射至一代組兩側睪丸。取出其他腫大的兔睪丸，放置于液氮保存管中，用紗布包扎并標記。4℃保存2 h后轉移至－20℃保存2～3 h后轉移至－70℃冰箱過夜保存，于次日保存于液氮罐中。

1.2.4 TPPA和RPR檢測 按標準方法進行TPPA和RPR檢測。5

2 統計學方法

對RPR滴度的倒數進行對數轉換后計算幾何平均滴度及95%CI。計數資料用t檢驗，計量資料用χ2檢驗。

3 實驗結果

表1 實驗兔接種時間、RPR滴度及TPPA實驗結果

表2 三代兔睪丸腫大、TPPA(＋)、RPR(≥1∶16)例數比較

見表1。其中1只實驗兔作為健康對照，其睪丸無腫大、RPR(－)、TPPA(－)。22只實驗兔全部感染Tp。原代、一代、二代組間RPR滴度≥1∶16的實驗兔比例差異有統計學意義(χ2＝12.299，P＝0.002)，見表2。原代組與一代、二代組相比，其RPR滴度≥1∶16的兔比例較低(χ2＝6.966，P＝0.008；χ2＝11.044，P＝0.001)；一代組RPR滴度≥1∶16的兔比例與二代組無統計學差異(χ2＝1.327，P＝0.249)。RPR幾何平均滴度在原代組與一代組、原代組與二代組間有統計學差異(P＜0.05)。一代組與二代組之間RPR幾何平均滴度無統計學差異(P＞0.05)。

4 討論

上個世紀20年代初期就開始進行梅毒的動物模型研究。在家兔中可形成實驗性梅毒感染，一般認為Tp在家兔的實驗感染和人的自然感染有相似之處。6倉鼠和豚鼠可在接種Tp部位發生損害但不典型；免疫受到抑制的鼠也可被感染，但不易成功。有研究表明，鼠對Tp的免疫反應較家兔慢，甚至難以產生兔免疫反應。7考慮到家兔對Tp的易感性，絕大多數建立的梅毒動物模型主要還是兔感染模型。8－11

在本文中，全部實驗兔在接種14天后感染Tp，說明利用本實驗方法可以成功建立實驗兔梅毒感染模型。據文獻報道，實驗兔接種Tp后一般14天左右睪丸腫大，經暗視野顯微鏡觀察Tp計數最多。所以在本研究中，接種14天后抽血檢測其血清學滴度，并致死實驗兔，取睪丸組織再次接種。根據文獻報道，在人體治療梅毒血清學下降4個滴度才可稱為治療有效。4原代組實驗兔在接種Tp Nichols 14天后RPR幾何平均滴度較低，說明在液氮中保存的復蘇菌株感染實驗兔14天后不宜進行藥效學評價實驗。一代、二代組實驗兔RPR滴度差異無統計學意義，且兩組RPR幾何平均滴度較高，說明接種14天后取睪丸中傳代培養的Tp Nichols菌株立即再次接種能夠提高實驗兔血清抗體滴度，且建立的兔梅毒感染模型更適合藥效學評價。當然本文存在一定的局限性:(1)本實驗在實驗兔接種14天后沒有進行后續觀察，RPR滴度隨著時間延長可能會繼續上升，RPR滴度在第14天不一定達到最高值；(2)因實驗兔為體重3.0～3.5 kg的新西蘭雄性健康兔，僅隨機抽取1只實驗兔抽血進行TPPA和RPR實驗排除梅毒感染的可能。

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3Khasawneh FA，Slaton MA，Katzen SL，et al.The prevalence and reliability of self－reported penicillin allergy in a community hospital.Int JGen Med，2013，6:905－909.

4王千秋，劉全忠，徐金華，等.性傳播疾病臨床診療與防治指南.上海:上海科學技術出版社，2014.86－87.

5尹躍平.性病防治培訓手冊—實驗室檢測.北京:人民衛生出版社，2011.17－25.

6 Lukehart SA，Marra CM.Isolation and laboratorymaintenance of Treponema pallidum.Curr Protoc Microbiol，2007，12:12A.1.

7Saunders JM，Folds JD.Humoral response of themouse to Treponema pallidum.Genitourin Med，1985，61(4):221－229.

8 Zhao F，Liu S，Zhang X，etal.CpG adjuvantenhances themucosal immunogenicity and efficacy of a Treponema pallidum DNA vaccine in rabbits.Hum Vaccin Immunother，2013，9(4):753－760.

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10 Fitzgerald TJ.Effects of cefetamet(Ro 15－8074)on Treponema pallidum and experimental syphilis.Antimicrob Agents Chemother，1992，36(3):598－602.

11 Lukehart SA，Baker－Zander SA，Holmes KK.Efficacy of aztreonam in treatment of experimental syphilis in rabbits.Antimicrob Agents Chemother，1984，25(3):390－391.

(收稿:2014－08－05 修回:2014－12－07)

Effect of Treponema pallidum continuous passage inoculation in rabbitsmodel on RPR titer

YU Rui-xing，YIN Yue-ping，HAN Yan，et al.Institute ofDermatology，Chinese Academy ofMedical Sciences，Nanjing，210042

Objective:To determine the effectof Treponema pallidum(Tp)of continuous passage inoculation in rabbits on RPR titer.M ethods:Twenty three New Zealand male rabbitswere divided into the primary group(5 rabbits)，the first generation group(9 rabbits)，the second generation group(8 rabbits)and the blank control group(1 rabbit).In the primary group，the testicles of rabbits were inoculated with Nichols strains stored in liquid nitrogen container.In the first generation group，the testicles of rabbitswere inoculated with the strains from the rabbits of the primary generation group.In the second generation group，the testicles of rabbitswere inoculated with the strains from the rabbits of the first generation group.The levels of RPR and TPPA in blood sera from earmargin veinswere detected after 14 days of the inoculation.Results:All the inoculated rabbitswere infected by Tp.The rates of the rabbitswith RPR titermore than or equal to 1∶16 in the primary group，the first generation group and the second generation group were 20%，88.9%and 100%.And the RPR geometricalmean in the primary group，the first generation group and the second generation group were 4.0，25.4 and 76.1.Conclusion:The serum titers of Tp increased in rabbits of continuous passage inoculation.

Treponema pallidum；New Zealand male rabbit；infection model

國家十一五“艾滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治”科技重大專項“防治性病對預防艾滋病的作用研究”(編號: 2008ZX10001－005)

中國醫學科學院皮膚病研究所，南京，210042?通信作者