枯草芽孢桿菌特異性PCR快速檢測方法的建立和應用

李天芝，于新友，沈志強,2

（1.山東綠都生物科技有限公司，山東濱州　256600；2.山東省濱州畜牧獸醫研究院，山東濱州　256600）

枯草芽孢桿菌特異性PCR快速檢測方法的建立和應用

李天芝1，于新友1，沈志強1,2

（1.山東綠都生物科技有限公司，山東濱州256600；2.山東省濱州畜牧獸醫研究院，山東濱州256600）

參照GenBank中登錄的枯草芽孢桿菌16S rRNA基因，設計1對引物，擴增片段大小為460 bp的基因片段，該方法對枯草芽孢桿菌檢測的靈敏性為1pg總DNA量，對枯草芽孢桿菌DNA的擴增結果為陽性，對照菌株擴增結果均為陰性，成功地建立枯草芽孢桿菌PCR檢測方法，且該方法具有快速、靈敏度高、特異性強等優點。

枯草芽孢桿菌；16S rRNA基因；PCR；方法

枯草芽孢桿菌是一種可形成芽孢的好氧革蘭氏陽性菌，該菌具有生長條件簡單、耐溫度變化、快速復活、快速生長和較強分泌酶等特點[1]。枯草芽孢桿菌是農業部允許作為飼料添加劑的兩種芽孢桿菌之一，在自然界中分布廣泛，易于分離培養，對人畜無毒無害，能產生脂肽類、氨基酸和磷脂類等多種抗菌素和酶，具有廣譜抗菌活性，可改善動物腸道菌群結構，增強免疫力，促進生長發育，提高生產性能的作用[2-3]。近年來，國內外對于枯草芽孢桿菌在飼料加工方面的應用有大量相關報道。豬飼料中添加一定量的枯草芽孢桿菌，能增強仔豬免疫力、提高生長性能[4]。蛋雞飼料中添加枯草芽孢桿菌，即能增加種雞的產蛋量和合格率，還能提高蛋的受精率、孵化率和健雛率[5]。肉雞飼料中添加枯草芽孢桿菌能改善其腸黏膜的抗氧化和免疫功能，從而提高肉雞的生長性能[6]。枯草芽孢桿菌添加到奶牛飼料中，能顯著提高奶牛產奶性能（P＜0.05）[7]。枯草芽孢桿菌添加到兔飼料中，能顯著促進幼兔腸道免疫系統發育[8]。16S rRNA基因可作為細菌鑒定的一種靶基因，在巴氏桿菌、蛭弧菌和鏈球菌等細菌種屬鑒定方面均有相關報道[9]。本研究根據GenBank登錄的枯草芽孢桿菌16S rRNA基因，設計引物，建立了枯草芽孢桿菌的PCR快速檢測方法。

1　材料與方法

1.1菌種和試劑

枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、弗氏弧菌、地衣芽孢桿菌均由實驗室保存。DNA回收試劑盒和質粒小量提取試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司，細菌基因組DNA快速提取試劑盒購自北京百泰克生物技術有限公司，馬丁肉湯培養基購自北京中海生物科技有限公司，rTaq聚合酶（Polymerase）購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2引物設計、合成

參照Genbank登錄的枯草芽孢桿菌16S rRNA基因序列（KF641815），用Primer primer5.0軟件分析后，設計1對引物：16S rRNA-F：5'-GGACG?GCTGAGTAACACG-3'，16S rRNA-R：5'-GACAA CGCTTGCCACCTA-3'，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3PCR模板制備

將枯草芽孢桿菌菌種接種馬丁肉湯液體培養基，置37℃培養箱中，培養18～20 h后，12 000 rpm離心2 min，PBS洗滌2次后，參照基因組DNA提取試劑盒說明書進行操作，提取細菌基因組DNA，同時提取其他幾種對照菌的DNA作為模板。

1.4PCR反應體系和程序

分別對PCR反應的所用的引物濃度（0.2～1.2 μmol·L-1，每0.2 μmol·L-1為1個梯度）和退火溫度（48～58℃梯度溫度，每2℃為1個梯度）進行優化，最后確定的擴增體系為：10×buffer 5 μL，dNTP 5 μL，引物16S rRNA-F 1 μL、引物16S rRNA-R 1 μL，rTaq Polymerase 0.5 μL，DNA模板1 μL，ddH2O補至50 μL。反應程序為：95℃5 min，94℃30 s，52℃30 s，72℃30 s，30個循環。

1.5PCR產物電泳檢測和測序分析

PCR反應結束后，取產物5 μL，進行1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增情況，如果有目的基因擴增條帶，用試劑盒回收后，與pMD18-T連接，轉入大腸桿菌DH5α感受態細胞內，提取初步鑒定為陽性的重組質粒，并送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，將測得序列與參照的枯草芽孢桿菌序列進行相似性比較。

1.6特異性檢測

分別以提取的枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、弗氏弧菌、地衣芽孢桿菌等6種細菌的基因組DNA作為模板，采用已建立的方法進行PCR檢測。

1.7敏感性檢測

測定制備的枯草芽孢桿菌DNA濃度，然后做不同程度的稀釋，使DNA的含量分別為10 ng·μL-1、1 ng·μL-1、100 pg·μL-1、10 pg·μL-1、1 pg·μL-1和0.1 pg·μL-1，分別取1 μL作為模板，按1.4優化的方法進行樣品的加樣和擴增反應。

1.8重復性檢驗

為驗證該方法的重復性和穩定性，采用建立的方法，分別重復檢測3次枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、弗氏弧菌、地衣芽孢桿菌的等6種細菌基因組DNA。

1.9檢測方法的應用

采用已經建立的方法對本實驗室已經分離和保存的42株疑似枯草芽孢桿菌檢測，將擴增的PCR產物全部測序，并與GenBank公布的序列進行比對和序列分析。并同時參照文獻進行檢驗，比較二者的符合性[10-11]。

2　試驗結果

2.1PCR產物的檢測和序列鑒定

PCR產物與pMD18-T連接后，送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，測序結果見圖1。將測得序列與GenBank登錄的序列進行比對分析，結果顯示與枯草芽孢桿菌（登錄號：KF641815）相應序列的相似性為100%。將PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示，在460 bp處可見一條特異性目的條帶，見圖2。

2.2特異性檢測

PCR特異性擴增檢測結果表明，只有以枯草芽孢桿菌DNA為模板時才能擴增出460 bp的預期目的帶，而對照菌株均無任何條帶擴增，見圖3。因此，建立的該PCR檢測方法特異性良好。

圖1　擴增產物測序結果

圖2　枯草芽孢桿菌PCR擴增結果

圖3　特異性實驗

2.3敏感性檢測

通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物，分別取5 μL樣品電泳，結果表明，該PCR方法可檢測的枯草芽孢桿菌的DNA的最低量為1pg，見圖4。

2.4重復性檢驗

重復性試驗結果顯示，3次重復試驗結果無任何差別，說明該方法有很好重復性，見圖5。

2.5檢測方法的應用

經PCR檢測和測序可知，42株疑似枯草芽孢桿菌分離菌中有7株為枯草芽孢桿菌，與采用相關國家標準的檢測結果完全一致，見圖6。

圖4　敏感性實驗

圖5　重復性實驗

圖6　檢測方法應用

3　討論

傳統的枯草芽孢桿菌實驗室檢測方法（病原分離與生化鑒定等）操作繁瑣，耗時長，費用高，準確性差，不能滿足基層工作者對枯草芽孢桿菌的快速和準確鑒定的需求。PCR方法以其特異性好、敏感性高和快速的特點已經廣泛用于細菌菌種鑒別、疾病臨床診斷和土壤微生物等多種領域。枯草芽孢桿菌存在于健康動物的腸道中，目前，已經從豬、雞、牛等多種動物體內成功分離到了枯草芽孢桿菌，并對其特性做了鑒定，為微生態制劑的研究奠定了基礎[11-13]。但從動物體內分離到的細菌眾多，本試驗枯草芽孢桿菌PCR檢測方法的建立，能快速的從多種分離菌中，對枯草芽孢桿菌做出甄別和初步篩選，從而減少工作強度。枯草芽孢桿菌能抑制大腸桿菌、沙門氏菌多種腸道致病菌的生長，而為乳酸桿菌等有益菌的生長提供適宜的生長環境，從而保持腸道菌群的平衡，提高動物機體抗病能力，同時枯草芽孢桿菌具有耐受高溫、耐酸、耐擠壓等特點，在飼料加工和儲存過程中不易失活[14-15]。作為一種飼料添加劑，具有無毒無害、無殘留等優點，能提高動物對飼料中營養物質的消化和吸收，增強動物抗病力，提高生產性能。采用本試驗建立的枯草芽孢桿菌PCR檢測方法，可對畜禽飼料中添加的枯草芽孢桿菌進行快速檢測和鑒別。

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Establishment and Application of a Specific PCR Assay for Detection ofBacillus Suhtilis

LI Tianzhi1,YU Xinyou1,SHEN Zhiqiang1,2

（1.Shandong Lvdu Biological Technology Co.,Ltd.,Binzhou Shandong 256600,China 2.Animal Husbandry and Veterinary Research Institute,Binzhou Shandong 256600 China）

A PCR assay for detection of Bacillus suhtilis was established using a pair of primers based on the 16S rRNA gene of Bacillus suhtilis.The size of the amplified product was 460 bp,and the specificity,sensitivity were studied.This method specifically amplified a fragment from Bacillus suhtilis with a detection limit of 1pg DNA of Bacillus suhtilis.Therefore the establishing PCR technique provided a sensitive,specific,fast and reliable method for diagnosis and epizootic study of the Bacillus suhtilis.

Bacillus suhtilis;16S rRNA gene;PCR;method

S852.61+6；S816.7

A

1001-0084（2015）12-0024-04

2015-11-16

山東省現代農業產業技術體系生豬產業創新團隊項目（SDAIT-06-022-15）；山東省現代產業技術體系家禽創新團隊生產與環境控制創新團隊項目（SDAIT-13-011-10）；山東省現代產業技術體系牛創新團隊項目（SDAIT-12-011-12）；山東省現代產業技術體系毛皮動物創新團隊項目（SDAIT-18-011-15）

李天芝（1985-），女，山東菏澤人，碩士，助理研究員，主要從事畜禽疾病診斷與防控研究。