HPLC法測定帕瑞昔布鈉中有關物質的方法研究

聶忠莉，郭兆元，蕭茂玲，王曉玲，張　勇，郭　瑞，葉　丁

（1.成都大學藥學與生物工程學院，四川 成都 610106；2.成都大學四川抗生素工業研究所，四川 成都 610106；3.成都克萊蒙醫藥科技有限公司，四川 成都 610041）

HPLC法測定帕瑞昔布鈉中有關物質的方法研究

聶忠莉1，郭兆元2，蕭茂玲1，王曉玲3，張勇3，郭瑞3，葉丁3

（1.成都大學藥學與生物工程學院，四川 成都 610106；2.成都大學四川抗生素工業研究所，四川 成都 610106；3.成都克萊蒙醫藥科技有限公司，四川 成都 610041）

建立以高效液相色譜法（HPLC）測定帕瑞昔布鈉中有關物質的方法。色譜柱為C18柱（4.6mm×250mm×5μm），乙腈-0.01mol/L磷酸氫二鈉溶液（用磷酸調節pH值至3.0）（47∶53，ν∶ν）為流動相，檢測波長為215nm，柱溫40℃。經過優化色譜條件后，帕瑞昔布鈉峰與6個已知雜質峰均可達到基線分離，樣品主峰及各雜質的色譜峰的靈敏度和分離度均滿足測定要求。采用HPLC法測定帕瑞昔布鈉中的有關物質，專屬性強，方法靈敏度高，結果準確可靠。

HPLC法；帕瑞昔布鈉；雜質；代地昔布

0　引　言

帕瑞昔布鈉是一種治療術后短期疼痛臨床用藥[1]。帕瑞昔布鈉是伐地昔布的非活性前體藥物，為水溶性藥物。水解后，生成伐地昔布[4-（5-甲基-3-苯基異惡唑-4-基）苯磺酰胺]和丙酸，能高選擇性地抑制COX-2[2]，在發揮良好鎮痛及抗炎作用[3]的同時，不影響胃腸道粘膜、血小板聚集及腎臟的功能。大量研究表明，帕瑞昔布鈉用于骨科[4]、普外科[5]、婦科[6]等臨床各科手術的術后鎮痛效果良好[7]，副作用較小，為需要經過非胃腸道給藥的手術期患者帶來了福音。

分析本品的合成工藝，并參考相關文獻[8-9]及專利[10]，本品中可能存在的有機雜質是：異噁唑（起始物料A）﹑中間體A、伐地昔布（中間體B）；雜質A﹑B﹑C﹑D﹑E﹑F、G、H、I、J、K、L。本文采用高效液相色譜法對本品中可能存在的雜質E、H、J、K、L、伐地昔布（中間體B）和異噁唑（起始物料A）等有關物質進行檢測和方法學驗證研究，結果顯示此方法專屬性強，靈敏度高，適用于帕瑞昔布鈉中有關物質的控制。其余的雜質不在本文研究之內。

1　儀器與試藥

儀器：Series 1500高效液相色譜儀；UV759CRT紫外可見分光光度計；BP 210D電子分析天平；KH5200E型超聲波清洗器（頻率40 kHz，超聲時長15 min）；pHS-3C酸度計（上海精密科學儀器有限公司雷磁儀器廠）。

試藥：帕瑞昔布鈉（工作對照品批號：130801；測定樣品批號：130903、130904、130905，成都克萊蒙醫藥科技有限公司，131101、131102、131103，成都通德藥業有限公司）；異噁唑、伐地昔布、雜質E、雜質J、雜質K、雜質H、雜質L對照品由成都克萊蒙醫藥科技有限公司研制；乙腈為色譜純，其他試劑為分析純。

2　方法與結果

2.1溶液的配制

2.1.1供試品溶液

取帕瑞昔布鈉樣品適量，精密稱定，用稀釋劑乙腈-水（47∶53，ν∶ν）制成0.4mg/mL的供試品溶液。

2.1.2對照品溶液

精密量取供試品溶液適量，加稀釋劑稀釋至0.4μg/mL作為對照溶液。

取異噁唑、伐地昔布、雜質E、J、K、H、L對照品與帕瑞昔布鈉，工作對照品各適量，精密稱定，用稀釋劑乙腈-水（47∶53，ν∶ν）溶解并稀釋制成每1mL中含帕瑞昔布鈉0.4mg、各雜質均為0.4μg的溶液，作為對照品溶液。

2.2測定波長的選擇

取異噁唑、伐地昔布、雜質E、J、K、H、L對照品與帕瑞昔布鈉對照品各適量，分別用乙腈-水（40∶60，ν∶ν）配置成0.02 mg/mL的溶液，照紫外-可見分光光度法[11]在200～400 nm范圍內掃描[12]，結果帕瑞昔布鈉、中間體及各雜質均具有較大的紫外末端吸收，最終選擇215 nm作為本品有關物質檢測波長。

表1　帕瑞昔布鈉有關物質分析方法色譜條件比較

圖1　帕瑞昔布鈉及雜質對照品定位色譜圖

2.3色譜條件的確定

參照注射用帕瑞昔布鈉進口注冊標準[13]，對帕瑞昔布鈉有關物質進行分離考察，并對色譜條件進行不斷優化，其結果見表1。

因此，本文選用色譜條件為C18柱（4.6 mm× 250mm×5μm），乙腈-0.01mol/L磷酸氫二鈉溶液（用磷酸調節pH值至3.0）（47∶53，ν∶ν）為流動相，檢測波長為215nm，柱溫40℃。

2.4系統適用性試驗及定位試驗

取2.1.2項雜質對照品溶液10μL按2.3項下條件進樣，記錄色譜圖，結果表明帕瑞昔布鈉主峰與雜質對照品的雜質峰（包含雜質E、伐地昔布、J、K、H、L、異噁唑）以及溶劑空白之間的分離度均在2.4以上，能完全分離；其出峰結果見圖1。

表2　有關物質強降解試驗結果

圖2　帕瑞昔布鈉樣品的專屬性試驗色譜圖

2.5強降解試驗

分別取帕瑞昔布鈉樣品適量，對其進行酸、堿、氧化、高溫及紫外光照等強降解試驗，按2.3項下條件進行測定，結果見表2和圖2。

由上述實驗結果可知：帕瑞昔布鈉對熱、酸、堿穩定，雜質基本無變化；對紫外燈光和氧化均不穩定，在不同的降解條件下，產生的雜質及雜質的變化量也不同；但最主要的變化量是氧化降解條件下，已知雜質中間體B（伐地昔布）達到了39.6%。在各降解條件下產生的雜質與主峰，以及雜質與雜質之間分離度均在1.5以上，能達到完全分離，主峰峰純度均達到0.9999，雜質峰峰純度基本均達0.99以上，峰降解平衡在95%～105%之間，結果表明該方法專屬性良好，能檢測出帕瑞昔布鈉在儲藏和運輸過程的極端條件下產生的降解產物。

2.6檢測限、定量限

取2.1.2帕瑞昔布鈉對照品溶液適量，加乙腈-水（47∶53，ν∶ν）稀釋至一定濃度，取此溶液適量按2.3項方法進樣，記錄色譜圖，同時走空白基線，以儀器基線噪音3倍峰高作為檢測限（S/N≥3），儀器基線噪音10倍峰高作為定量限（S/N≥10），得各雜質的定量限與檢測限如表3所示。

表3　帕瑞昔布鈉有關物質檢測限、定量限試驗

2.7線性

精密稱取帕瑞昔布鈉及各雜質對照品適量，用乙腈-水（47∶53，ν∶ν）溶解并稀釋至適宜濃度，精密量取各溶液10μL按2.3方法檢測，記錄色譜圖。以濃度-峰面積做曲線，結果表明：在4.00～497.14μg/mL范圍內，帕瑞昔布鈉線性方程為Y=32.31x+16.04；r2=0.999 4；在0.10～5.0 μg/mL范圍內，雜質E（Y=44.66x-1.60；r2=0.998 4）、伐地昔布（Y=42.397x+ 1.49；r2=0.9997）、雜質J（Y=43.42x+1.33；r2=0.9997）、雜質K（Y=34.60x+1.1；r2=0.9997）、雜質H（Y=21.19x+ 3.64；r2=0.9912）、雜質L（Y=35.20x+1.14；r2=0.9998）、異噁唑（Y=42.90x+1.09；r2=0.9998）色譜峰面積與其濃度均有良好的線性關系。

2.8重復性試驗和中間精密度

6份帕瑞昔布鈉樣品，分別稱取一定量并加乙腈-水（47∶53，ν∶ν）溶解稀釋制成0.4mg/mL的供試品溶液，取此溶液適量按2.3項方法進樣，記錄色譜圖。6份樣品中，未知雜質按未加校正因子的自身對照法計算含量，已知雜質按峰面積外標法計算含量，結果顯示6份樣品均只檢出伐地昔布和雜質K兩個雜質，RSD分別為：4.77%、3.46%；其他雜質均未檢出，重復性良好。

由不同人員在不同時間、不同儀器上對同一批號樣品測定12次，各雜質的平均含量分別為：伐地昔布0.0128%、雜質K 0.0154%、總雜質0.0282%；RSD分別為：伐地昔布4.91%、雜質K 4.75%、總雜質4.34%，中間精密度良好。

2.9供試品溶液穩定性

取2.1.2項下對照品溶液，在室溫下分別放置0，2，4，8，16，24h，按2.3方法檢測，溶液在24h內都未產生任何新的雜質，如表4所示。

表4　帕瑞昔布鈉有關物質穩定性試驗（n=6）

2.10回收率試驗

精密稱定帕瑞昔布鈉（130801）10mg（共10份）分別加入上述50%對照品溶液、100%對照品溶液、150%對照品溶液1.0mL各3份使樣品溶解，分別作為50%、100%、150%的供試品溶液；剩余一份加入乙腈-水（47∶53，ν∶ν）使溶解，作為供試樣品溶液。分別取上述對照品溶液、供試品溶液、供試樣品溶液按2.3項方法進樣，記錄色譜圖，回收率結果見表5。各雜質回收率良好。

表5　帕瑞昔布鈉有關物質平均回收率

2.11耐用性

在檢測波長、柱溫、流動相流速、pH值、流動相比例發生微小變化的情況下，按2.3方法檢測，樣品中雜質個數和雜質量，以及各成分峰之間的分離度與原條件幾乎無變化；但當色譜柱發生改變時，雜質H的出峰保留時間發生變化，且變化較大，但測定雜質含量變化不是很大，由此可證明在色譜柱不發生變化的情況下，本方法的耐用性良好；另從樣品雜質檢測情況看，各批樣品中均未檢測出雜質H，若本品中不存在雜質H的情況下，色譜柱的耐用性也可視為良好。

3　結果與討論

3.1有關物質檢測進樣濃度的確定

根據化學藥物研究技術指導原則對有關物質限度的要求，原料的雜質報告限度、鑒定限度、質控限度分別為0.05%、0.10%、0.15%（每日最大劑量＜2g），本品每日的最大劑量為80 mg帕瑞昔布，因此為了保證0.05%的雜質能檢出，根據本品的檢測限試驗結果，以進樣10μL計算，有關物質檢查的濃度至少應為0.43ng/10 μL/0.05%/103=0.086 mg/mL，參照帕瑞昔布鈉進口注冊質量標準有關物質檢測的進樣濃度及本品制劑規格，確定有關物質檢測濃度為0.4mg/mL，進樣量為10μL。

3.2色譜圖記錄時間的確定

由破壞試驗結果可知，已知雜質峰及其破壞條件下產生的雜質峰均在主峰的3.5倍保留時間內，故確定供試品溶液色譜圖記錄時間為主峰保留時間的3.5倍。

4　結束語

通過上述實驗結果表明：在優化的帕瑞昔布鈉有關物質色譜條件下，破壞產生的雜質與主峰，以及雜質與雜質之間分離度均在1.5以上，能達到完全分離，主峰峰純度均達到0.999 9，雜質峰峰純度基本為0.99以上；各破壞樣品的物料平衡均在95%～105%之間，說明該方法專屬性良好，能檢測出本品在儲藏和運輸過程的極端條件下產生的雜質。

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Research on HPLC method for related substances in parecoxib sodium

NIE Zhongli1，GUO Zhaoyuan2，XIAO Maoling1，WANG Xiaoling3，ZHANG Yong3，GUO Rui3，YE Ding3
（1.School of Pharmacy and Bioengineering，Chengdu University，Chengdu 610106，China；2.Sichuan Industrial Institute of Antibiotics，Chengdu University，Chengdu 610106，China；3.Chengdu Climb Pharmaceutical Technology Co.，Ltd.，Chengdu 610041，China）

To determine related substances in parecoxib sodium with high performance liquid chromatograph（HPLC）.C18 column has been used as filler（4.6 mm×250 mm×5 μm）and acetonitrile-0.01 mol/L ammonium dihydrogen phosphate（adjusted to pH 3.0 with phosphoric acid）（47∶53，ν∶ν）as mobile phase.The detection wavelength was set at 215nm and the column temperature 40℃.After the optimization of chromatographic conditions，the parecoxib sodium peak and 6 known impurity peaks meet the requirement of baseline separation.The sensitivity and resolution of the main peak of the samples and the chromatographic peak of all the impurities are both acceptable.The HPLC method is specific and reliable.

HPLC method；parecoxib sodium；impurities；valdecoxib

A

1674-5124（2015）12-0054-05

10.11857/j.issn.1674-5124.2015.12.014

2015-04-01；

2015-06-06

聶忠莉（1966-），女，副主任藥師，主要從事藥物分析研究。