當歸補血湯對尿毒癥大鼠心肌纖維化組織瞬時受體電位M7通道表達及膠原蛋白合成的影響*

王琳娜，陳常勇，陳小永，郭存霞，陳香美

[1.河南省中醫院腎病科，河南 鄭州 450002；2.中南大學湘雅醫院放射科，湖南 長沙 410008；3.中國人民解放軍總醫院腎臟病科（腎臟疾病國家重點實驗室），北京 100853]

·論著·

當歸補血湯對尿毒癥大鼠心肌纖維化組織瞬時受體電位M7通道表達及膠原蛋白合成的影響*

王琳娜1，陳常勇2，陳小永1，郭存霞1，陳香美3

[1.河南省中醫院腎病科，河南 鄭州 450002；2.中南大學湘雅醫院放射科，湖南 長沙 410008；3.中國人民解放軍總醫院腎臟病科（腎臟疾病國家重點實驗室），北京 100853]

目的觀察當歸補血湯（DBD）對尿毒癥大鼠心肌組織瞬時受體電位M7通道（TRPM7）表達及膠原蛋白合成的影響，探討DBD抗尿毒癥心肌纖維化（UMF）作用機制。方法采用腺嘌呤核苷酸灌胃制作尿毒癥模型，雄性SD大鼠32只，隨機分為對照組、模型組、依那普利組及DBD組。依那普利和DBD組自造模第1天開始分別以依那普利10 mg/（kg·d）或DBD 6 g/（kg·d）灌胃；直至第21天，模型組和對照組以等體積的生理鹽水灌胃。造模后第21天處死大鼠，留取血液標本檢測血清尿素氮（BUN）、肌酐（Scr）和心肌肌鈣蛋白Ⅰ（cTnⅠ）。留取心肌標本，行蘇木精-伊紅染色（HE）和Masson染色，觀察各組大鼠心肌組織病理改變。采用實時定量逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測心肌組織TRPM7 mRNA和轉化生長因子-β1（TGF-β1）mRNA的表達。應用Western blot檢測心肌組織TRPM7、Ⅰ型膠原蛋白（ColⅠ）和Ⅲ型膠原蛋白（ColⅢ）的表達。結果 與對照組比較，模型組大鼠心肌病理評分增加，心肌間質膠原蛋白相對面積增大，血清BUN、Scr和（cTnⅠ）水平提高，TRPM7 mRNA和TGF-β1mRNA的表達增強，心肌組織TRPM7、ColⅠ和ColⅢ的表達增強。與模型組比較，經依那普利和DBD治療后，心肌組織病理評分和心肌間質膠原蛋白相對面積縮小，血清BUN、Scr和cTnⅠ水平下降，TRPM7 mRNA和TGF-β1mRNA的表達減弱，心肌組織TRPM7、ColⅠ和ColⅢ的表達減弱，差異有統計學意義（P＜0.05）。與依那普利組比較，DBD組能明顯降低TGF-β1mRNA的表達。結論DBD可減輕尿毒癥大鼠心肌纖維化程度，這一作用與抑制心肌組織TRPM7表達，從而抑制膠原蛋白合成有關。

心肌纖維化；尿毒癥；瞬時受體電位M7通道；當歸補血湯

心血管疾病是慢性腎疾病的常見并發癥，尿毒癥心肌纖維化（uremic myocardial fibrosis，UMF）是在慢性腎疾病基礎上并發心肌肥大和心室重塑的主要病理基礎[1]。成纖維細胞是主要心肌細胞之一，占心肌細胞總量的75%。近期研究表明，鈣離子通道在心肌成纖維細胞增殖、分化和細胞外基質（extracellular matrix，ECM）成分的合成中起重要作用[2]。瞬時受體電位通道（transient receptor potential，TRP）是Ca2+、Mg2+陽離子信號通道，其在心肌成纖維細胞中廣泛表達，瞬時受體電位M7通道（transient receptor potential melastatin 7，TRPM7）在轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β1）信號通路中也起重要的調節作用。那么TRPM7在UMF組織中的表達如何，當歸補血湯（danggui buxue decoction，DBD）對UMF和TRPM7表達有無影響，目前未見報道。本實驗擬通過UMF大鼠模型觀察TRPM7、TGF-β1、Ⅰ型膠原蛋白（collageⅠ，ColⅠ）及Ⅲ型膠原蛋白（collageⅢ，ColⅢ）表達的變化，探討DBD抗纖維化作用與TRPM7的相關性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

清潔級雄性Sprague Dawley大鼠32只，體重180～220 g，由河南省中醫院實驗動物中心提供，分為造模組（24只）和對照組（8只）。造模組以3%腺嘌呤核苷酸灌胃制備尿毒癥大鼠模型，21 d成模后再分為模型組、DBD組和依那普利組，每組8只大鼠。DBD組自造模第1天開始給予DBD 6 g/（kg·d）直至第21天；依那普利組自造模第1天開始給予依那普利10 mg/（kg·d）直至第21天；模型組和對照組給予等量生理鹽水灌胃。

1.2 主要材料

總RNA提取試劑盒（R Neasy Mini Kit試劑盒）購自美國Qiangen公司，逆轉錄試劑盒購自美國Promega公司，實時定量逆轉錄-聚合酶鏈反應（real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，real-time PCR）試劑盒（q-PCR Mixture）購自日本TaKaRa公司，熒光探針實時定量PCR儀（ABI 7900HT）購自美國Applied Biosystems公司。real-time PCR所用引物由上海生物工程有限公司合成，大鼠心肌肌鈣蛋白Ⅰ（cardiac troponinⅠ，cTnⅠ）試劑盒購自美國LDI公司，羊抗ColⅠ和羊抗ColⅢ多克隆抗體購自美國Santa Cruze公司，鼠抗TRPM7單克隆抗體和鼠抗β-actin單克隆抗體購自美國Sigma公司，二抗購自美國Sigma公司，增強化學發光（enhanced chemiluminescence，ECL）顯色液購自美國Pierce公司。

1.3 觀察指標及檢測方法

1.3.1 血肌酐（serum creatinine，Scr）、尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）及cTnⅠ的檢測各組大鼠處死，經心臟取血2 ml，冰上靜置10 min，4℃離心，取上清液，置入-20℃冰箱保存。全自動生化分析儀檢測Scr、BUN水平，酶聯免疫吸附試驗（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）檢測血清中cTnⅠ的含量。

1.3.2 心肌組織蘇木精-伊紅染色（hematoxylin-eosin staining，HE）心肌組織以4%多聚甲醛固定，常規包埋、切片，行HE染色，觀察腎組織病理變化，由高年資病理醫師進行心肌細胞的光鏡檢查。評分分3個部位：右室前乳頭肌連同右室前游離壁、室間隔及左室前乳頭肌連同左室前壁，最后累積記分。評分標準為：0分，無明顯變性、炎癥細胞浸潤及間質纖維化；1分，散在的小灶性變性、炎癥細胞浸潤及間質纖維化；2分，局灶狀變性、炎癥細胞浸潤及間質纖維化；3分，廣泛的彌漫性變性灶伴大片炎癥細胞浸潤及間質纖維化。

1.3.3 心肌組織Masson染色心肌組織以4%多聚甲醛固定，常規包埋、切片，Masson染色觀察腎組織膠原蛋白沉積，每例切片低倍鏡下觀察10個互不重疊的腎小管間質視野。計算每張切片心肌間質Masson染色陽性面積占整個視野的百分比，作為心肌膠原蛋白含量的半定量分析。計分標準如下：0分為無著色；1分為輕度，陽性面積＜10%；2分為中度，陽性面積11%～25%；3分為重度，陽性面積26%～50%；4分為極重度，陽性面積＞50%。

1.3.4 TRPM7、TGF-β1的RT-PCR檢測①組織總RNA的提取：按照R Neasy Mini Kit試劑盒說明書提取組織總RNA，抽提的總RNA用紫外分光光度計測光密度值，比值為1.9～2.0。取3μl RNA用1%瓊脂糖凝膠電泳，可見5、18和28 S 3條清晰的RNA帶，提示RNA無污染和降解。②cDNA的合成：用逆轉錄試劑盒合成cDNA，再以該cDNA為模板進行RT-PCR反應操作。RT-PCR的引物序列如下，β-actin正向引物：5'-GGCCAACCGTGAAAAGATG A-3'，反向引物：5'-GACCAGAGGCATACAGGGACA A-3'；TGF-β1正向引物：5'-CAACAATTCCTGGCGT TACCTT-3'，反向引物：5'-AAGCCCTGTATTCCGTCT CCTT-3'；TRPM7正向引物：5'-CCGGAATTCCGGAT GAAACCCAAATCCATACCAT-3'，反向引物：5'-CGC GGATCCGCGCTATAACATCAGACGAAGAGAA-3'。③RT-PCR檢測：在ABI 7900型熒光定量PCR儀上進行擴增，96孔板加樣，設計復孔和標準曲線，用Se-quence Detection System軟件分析各檢測樣本的Ct值（達到一定熒光閾值的循環數），計算2-ΔΔCt，評價TGF-β1和TRPM7在心肌組織中的表達水平。1.3.5心肌組織TRPM7、ColⅠ及ColⅢ的Western blot檢測①心肌總蛋白質的提取。取組織塊100 mg加入組織總蛋白提取液1 ml勻漿，冰上裂解30 min，4℃、12 000 r/min離心15 min，取上清液，按Bio-rad蛋白定量試劑盒說明書進行蛋白定量，取80μl上清加5×變性緩沖液20μl混勻，100℃下變性10 min。②Western blot檢測。灌制10%分離膠和4%堆積膠，取總蛋白100μg行上樣電泳，電泳結束后260 mA電轉印90 min至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜。封閉液（5%牛奶）搖床上封閉2 h，加入抗TRPM7（1∶100）、ColⅠ（1∶200）、ColⅢ（1∶200）和β-Actin抗體（1∶100），4℃搖床過夜。洗膜后再加相應的二抗，室溫孵育1 h，加ECL液后顯影、定影，以β-actin為內參照。將膠片掃描后，采用Quantity One軟件分析各條帶灰度值，將各目的條帶灰度值除以同一標本內參照β-actin條帶灰度值得到比值，將該比值除以同一膠片上對照組的比值做為該目的蛋白表達量的半定量結果。

1.4 統計學方法

采用SPSS 18.0統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 血清Scr、BUN及cTnⅠ水平

模型組大鼠血清Scr、BUN及cTnⅠ水平較對照組明顯增高（F=287.122、367.371和90.041，P=0.000）。經DBD治療后，大鼠血清SCr、BUN及cTnⅠ水平較模型組明顯降低（F=87.122、67.371和30.041，P= 0.000、0.002和0.005），差異有統計學意義。經依那普利治療后，大鼠血清SCr、BUN及cTnⅠ水平較模型組明顯降低（F=76.901、69.055和26.621，P=0.000、0.003和0.006），差異有統計學意義。DBD組和依那普利組大鼠血清Scr、BUN及cTnⅠ水平比較，差異無統計學意義（F=0.124、0.102和0.087，P=0.892、0.900和0.963）。見表1。

2.2 心肌組織病理改變

2.2.1 HE染色對照組大鼠心肌纖維排列整齊，結構清晰，細胞質豐富均勻，細胞核呈圓形或橢圓形，位于細胞中央，核仁清晰，未見心肌纖維變性、壞死的病理性改變。模型組大鼠心肌纖維排列紊亂，部分心肌細胞質強嗜伊紅染成深粉紅色，細胞核固縮變性，核仁消失，心肌間隔明顯增寬，間質纖維化，間質明顯水腫，可見淋巴細胞浸潤。依那普利組大鼠心肌與模型組比較，病變程度輕、病變范圍小，心肌纖維排列尚可，結構清晰，少量心肌細胞質強嗜伊紅染成深粉紅色，細胞核固縮變性，核仁消失，心肌纖維間隔略增寬，間質輕度水腫，偶見淋巴細胞浸潤。DBD組大鼠心肌與模型組比較，病變程度明顯減輕、心肌纖維排列清晰，心肌纖維間隔略增寬，間質輕度水腫，偶見淋巴細胞浸潤。見圖1、2。

表1 各組大鼠血清Scr、BUN和cTnⅠ水平比較（n=8±s）

表1 各組大鼠血清Scr、BUN和cTnⅠ水平比較（n=8±s）

注：1）與對照組比較，P＜0.01；2）與模型組比較，P＜0.01；3）與依那普利組比較，P＞0.05

組別SCr/（μmol/l）BUN/（mmol/l）cTnⅠ/（ng/ml）對照組23.00±5.625.12±0.240.12±0.05模型組270.54±95.361）52.28±17.251）0.29±0.031）依那普利組108.94±41.322）21.15±15.642）0.21±0.052）DBD組105.81±65.272）3）22.84±19.372）3）0.20±0.062）3）F值87.12267.37130.041 P值0.0000.0020.005

圖1 各組大鼠心肌組織病理改變（HE×200）

圖2 各組大鼠心肌組織損傷評分

2.2.2 Masson染色普通光學顯微鏡下觀察心肌組織Masson染色切片，心肌細胞呈紅色，細胞核呈藍色，膠原蛋白纖維呈綠色。對照組心肌組織無膠原蛋白沉積；模型組心肌組織可見大量染成綠色的膠原蛋白纖維；依那普利組和DBD組心肌可見少量染成綠色的膠原蛋白纖維。見圖3、4。

圖3 各組大鼠心肌組織病理改變（Masson×200）

圖4 各組大鼠心肌組織膠原蛋白相對面積

2.3 Real-time PCR檢測

模型組大鼠心肌組織TRPM7 mRNA和TGF-β1mRNA的表達較對照組明顯增多（F=104.136和167.175，P=0.000）；依那普利組大鼠心肌組織TRPM7 mRNA和TGF-β1mRNA的表達較模型組減少（F=35.091和45.971，P=0.001和0.000）；DBD組大鼠心肌組織TRPM7 mRNA和TGF-β1mRNA的表達較模型組也減少（F=49.033和77.175，P= 0.001和0.000），差異有統計學意義。DBD組和依那普利組的TRPM7 mRNA表達比較（F=1.106，P=0.992），差異無統計學意義；TGF-β1mRNA的表達比較（F= 15.274，P=0.041），差異有統計學意義。見表2。

表2 各組大鼠腎組織TRPM7 mRNA和TGF-β1mRNA表達（n=8±s）

表2 各組大鼠腎組織TRPM7 mRNA和TGF-β1mRNA表達（n=8±s）

注：1）與對照組比較，P＜0.01；2）與模型組比較，P＜0.01；3）與依那普利組比較，P＜0.05

組別例數TRPM7TGF-β1對照組61.00±0.051.00±0.03模型組82.54±1.061）4.32±1.351）依那普利組81.94±1.002）2.29±1.672）DBD組81.91±0.572）1.94±1.032）3）F值49.03377.175 P值0.0010.000

2.4 Western blot檢測

模型組TRPM7、ColⅠ及ColⅢ的表達較對照組明顯增多（F=173.558、133.098和129.366，P=0.000），差異有統計學意義；依那普利組心肌組織TRPM7、ColⅠ及ColⅢ的表達較模型組減少（F=98.655、87.654和83.781，P=0.001）；DBD組心肌組織TRPM7、ColⅠ及ColⅢ的表達較模型組減少（F=102.687、89.064和90.386，P=0.000、0.000和0.001），差異有統計學意義；依那普利組和DBD組心肌組織TRPM7、ColⅠ及ColⅢ的表達比較（F=1.032、1.028和1.009，P=0.912、0.961和0.985），差異無統計學意義。見圖5。

圖5 各組大鼠心肌組織TRPM7、ColⅠ及ColⅢ表達的變化

3 討論

UMF是在慢性腎臟病基礎上并發心肌肥大和心室重塑的主要病理基礎。瞬時受體電位通道是位于細胞膜上的一類重要陽離子通道蛋白，在心肌成纖維細胞中廣泛表達，是心肌成纖維細胞中主要的Ca2+離子通道[3]。TRPM7為TRP家族成員之一，是具有陽離子通道和蛋白激酶雙重結構的雙功能膜蛋白。TRPM7通過調節細胞內Ca2+平衡，調控成纖維細胞增殖、活化和細胞外基質沉積等，在TGF-β促纖維化作用信號通路中起重要作用[4]。

cTnⅠ是心肌細胞胞漿內的特異性抗原，在正常心肌組織中cTnⅠ均勻分布；在心肌損傷時，cTnⅠ易從心肌細胞中釋放入血。

DBD是金元時代李東垣所著《內外傷辯惑論》的經典益氣補血方劑，由黃芪和當歸以5∶1組成。該方劑在配伍時重用黃芪大補脾腎之氣，以資氣血生化之源，配以當歸苷辛而溫，養血和營，黃芪為君，當歸為臣。黃芪甲苷是黃芪的主要成分之一，是評價黃芪藥材質量的優劣標準，有明確的心肌保護作用。黃芪甲苷能通過下調TGF-β及其下游p-Smad2/3和Smad4的表達，抑制ColⅠ沉積，抑制病毒性心肌炎心肌纖維化形成[5]。阿魏酸為非胍類內皮素受體拮抗劑，是當歸的主要有效成份之一，為其活血成分的主要物質基礎。阿魏酸具有抗血小板聚集、抗炎、抗氧化作用，拮抗心、肝、腎組織纖維化的形成[6-7]。

DBD的配伍有明確的科學依據。黃芪中的主要成分—黃芪甲苷難溶于水，生物利用度差，而當歸中主要成分阿魏酸能明顯促進黃芪甲肝在大鼠十二指腸的吸收[8]，同時芪歸配比5∶1組阿魏酸析出比例最高；芪歸配比5∶1對大鼠免疫功能及抗炎能力改善影響最大[9]。孟立強[10]、MENG[11]、孫麗霞等[12]對黃芪當歸的配伍抗纖維化的研究發現，黃芪當歸配伍對肝、腎纖維化有多靶點抑制作用。

前期研究表明，DBD含藥血清能抑制心肌成纖維細胞的增殖、活化及分泌ColⅠ。利用DBD對自發性高血壓大鼠進行早期干預能抑制TGF-β和結締組織生長因子的表達，改善腎間質纖維化及血管病變。本研究擬在前期研究的基礎上，進一步觀察DBD對尿毒癥大鼠心肌纖維化及心肌組織TGF-β1、TRPM7及膠原蛋白合成的影響。

本研究發現，腺嘌呤核苷酸造模21 d大鼠，Scr、BUN及cTnⅠ較對照組明顯升高，心肌間質出現水腫、炎癥細胞浸潤和纖維化改變。說明尿毒癥大鼠腎功能損傷同時伴隨心肌損害。經依那普利和DBD治療后，Scr、BUN、cTnⅠ和心肌損害評分比模型組明顯降低，說明DBD和依那普利在改善腎功能的同時對心肌損害也有一定的保護作用。模型組大鼠TGF-β1mRNA、TRPM7 mRNA、TRPM7、ColⅠ及ColⅢ的表達明顯增強。說明伴隨心肌纖維化損害同時出現TGF-β1、TRPM7表達增強，ECM成分沉積增多，TRPM7表達與心肌纖維化呈正相關。經DBD和依那普利治療后，上述指標明顯降低。DBD治療組的TGF-β1mRNA表達與依那普利組比較明顯降低，說明DBD抑制纖維化主要因子表達的作用優于依那普利。該作用說明中藥復合成分的多靶點長時程抗纖維化作用強于腎素-血管緊張素系統抑制劑。腎素-血管緊張素系統抑制劑在纖維化早期的作用要強于纖維化形成期和晚期，該作用與筆者前期在腎間質纖維化中的研究結果一致[13]。DBD能明顯改善UMF組織的病理改變，減少心肌組織TGF-β1、TRPM7的表達，減少ECM成分，對UMF起明顯的治療作用。

隨著對UMF認識的深入，抗纖維化治療在UMF的發生中越來越受到重視。TRPM7-Ca2+信號通路的存在為心肌纖維化治療提供新的策略。DBD配方簡單，抗心肌纖維化作用明顯，值得進一步臨床應用推廣。

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（張蕾 編輯）

Effect of Danggui Buxue Decoction on expression of transient receptor potential melastatin 7 and collagen synthesis in myocardial fibrosis tissue of uremia rats*

Lin-na WANG1,Chang-yong CHEN2,Xiao-yong CHEN1, Cun-xia GUO1,Xiang-mei CHEN3
[1.Department of Nephrology,Henan Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine, Zhengzhou,Henan 450002,P.R.China;2.Department of Radiology,Xiangya Hospital,Central South University,Changsha,Hunan 410008,P.R.China;3.Department of Nephrology (State Key Laboratory of Kidney Disease),the General Hospital of Chinese PLA,Beijing 100853,P.R.China]

【Objective】To investigate the effect of Danggui Buxue Decoction(DBD)on the expression of transient receptor potential melastatin 7(TRPM 7)and collagen synthesis in rats of uremia myocardial fibrosis (UMF).【Methods】UMF model was induced by gavage of adenine nucleotide.Male Sprague-Dawley rats(n=32)were randomly divided into control group,UMF model group,Enalapril group and Danggui Buxue Decoction(DBD)group.The rats were treated with Enalapril 10 mg/(kg·d）or DBD 6 g/(kg·d）by gastric gavage in the Enalapril group and Danggui Buxue Decoction group,respectively.The rats were treated with identical dose of normal saline in the control and model groups.All the rats were sacrificed on the 21st day.Serum creatinine(Scr),urea nitrogen(BUN)and troponinⅠ(cTnⅠ)were measured.Pathological changes of the myocardial tissue were observed under light microscopy by HE and Masson staining.The expressions of TRPM 7 mRNA and TGF-β1mRNA were detected by real-time PCR.The expressions of TRPM 7,collagenⅠ(ColⅠ)and collagenⅢ(ColⅢ)were detected by Western blot.【Results】Compared with the control group, serum creatinine,urea nitrogen and troponinⅠ,the myocardial tissue pathologial damage index,relative collagen area,the expressions of TRPM 7 mRNA and TGF-β1mRNA and the levels of TRPM 7,ColⅠand ColⅢin the uremia myocardial tissue significantly increased in the model group(P＜0.05).After the treatment by Enalapril and DBD,there were significant reductions in myocardial tissue damage index,relative collagen area and the levels of BUN,Scr and cTnⅠin the Enalapril group and DBD group(P＜0.05).Meanwhile,Enalapril and DBD inhibited the expression of TRPM7 mRNA,TGF-β1mRNA,TRPM 7,ColⅠand ColⅢcompared with the model group(P＜0.05).Compared with the Enalapril group,DBD attenuated the expression of TGF-β1mRNA.【Conclusions】DBD significantly attenuates myocardial fibrosis by supressing the expression of TRPM 7 and then ameliorating collagen deposition.It may be one of the anti-fibrosis mechanisms of DBD in uremia myocardial tissue.

myocardial fibrosis；uremia；transient receptor potential melastatin 7；Danggui Buxue Decoction

1005-8982（2015）30-0007-06

2015-04-22

河南省中醫藥科學研究專項課題（No：2014ZY02021）

R285；R-332

A