生鮮乳中皮革水解蛋白（L-羥脯氨酸）檢測方法的探討

文/趙彩會 趙佳苗 田 間 賈 青

〔農業部飼料質量監督檢驗測試中心（西安）〕

2009年2月6日，原衛生部公布了《食品中可能違法添加的非食用物質和易濫用的食品添加劑品種名單（第二批）》，其中就包括皮革水解物。皮革水解物被添加到生鮮乳中以提高蛋白質含量。皮革水解物的檢測難度較大，而L-羥脯氨酸是其特征氨基酸，因此檢測生鮮乳中的皮革水解物，就是檢測牛奶中的L-羥脯氨酸。2009年，原衛生部指定了其參考檢測方法是《乳與乳制品中動物水解蛋白鑒定方法》。現在各監測機構都在用此方法。該方法的檢測步驟主要為：稱取一定量生鮮乳，加入鹽酸，110℃水解，然后轉移、定容，從中移取少量溶液調節pH值后再定容，最后進行氧化反應和顯色反應，558 nm比色測定。此方法檢測限低、重復性好、定量準確。同時該方法也存在缺點，在進行大批量樣品檢測時，過程較復雜、用時較長，尤其是每一個樣品都要調節pH值。本文在該方法基礎上嘗試探討了一種較為簡便快捷的檢測方法，即減少樣品量，并進行充分稀釋，省去了調節pH值和反復移取、定容步驟，直接進行氧化和顯色反應。

1 試驗材料和方法

1.1 主要儀器設備

分光光度計（560 nm），氮吹儀，恒溫干燥箱（110℃），水浴鍋（60℃），具塞玻璃水解管（10 mL，110℃）。

1.2 主要試劑

1.2.1 鹽酸

分析純。

1.2.2 緩沖溶液

將50 g檸檬酸、26.3 g氫氧化鈉和146.1 g結晶乙酸鈉溶于水，稀釋至1 L，再將此溶液與200 mL水和300 mL正丙醇混合。

1.2.3 氯胺T溶液

將1.41 g氯胺T溶于10 mL水中，依次加入10 mL正丙醇和80 mL緩沖溶液（1.2.2），現用現配。

1.2.4 顯色劑

稱取10 g對二甲氨基苯甲醛，用35 mL高氯酸溶解，緩慢加入65 mL異丙醇。

1.2.5 L-羥脯氨酸標準儲備液（1.0 mg/mL）

稱取100.00 mg L-羥脯氨酸標準品，用少量水溶解，加入1 滴6 mol/L鹽酸，再用水定容至100 mL容量瓶中，搖勻。

1.2.6 標準工作液（20.0 μg/mL）

準確吸取標準儲備液（1.2.5）2.00 mL于100 mL容量瓶中，用水定容，搖勻。

1.3 試驗方法

1.3.1 測定步驟

（1）樣品處理

準確稱取生鮮乳2.00 g（精確到0.0001 g）于水解管中，加入濃鹽酸2.00 mL和2 滴50 g/L苯酚溶液，氮吹3 min，在充氮氣的狀態下封口。將已封口的水解管放入110℃恒溫干燥箱內，水解6 h后取出，打開水解管，將水解液用濾紙過濾到250 mL容量瓶中，并用水反復沖洗水解管和濾紙，洗液并入容量瓶中，定容，搖勻待測。

（2）標準工作曲線溶液的配制

準確吸取濃度為20.0 μg/mL標準工作液0.00、2.50、5.00、7.50、10.00 mL，分別于100 mL容量瓶中，用水定容，搖勻，濃度分別為0.0、0.5、1.0、1.5、2.0 μg/mL。

（3）檢測

分別準確移取配制好的標準工作曲線溶液和待測水解液5.00 mL于水解管中，加入2.00 mL氯胺T（現用現配），室溫靜置20 min，再加入2.00 mL顯色劑，60℃水浴20 min。取出迅速冷卻至室溫，在560 nm波長下測定樣品吸光值。

1.3.2 準確度試驗

取10 支水解管，每管中準確稱量2.00 g空白生鮮乳，再分別準確加入濃度為1.0 mg/mL的L-羥脯氨酸儲備液0、100、200、400、500 μL，2個平行，制成空白樣品和L-羥脯氨酸的添加量分別為50、100、200、250 μg/g的加標樣品。各樣品按1.3.1測定步驟進行檢測。

1.3.3 精密度試驗

取1.3.2中添加量為100 μg/g的樣品，按1.3.1測定步驟重復測定6 次，計算相對標準偏差。

1.4 含量計算公式

C—從標準曲線求得的樣品溶液L-羥脯氨酸的濃度，μg/mL；

V—樣品溶液的體積，mL；

m—樣品的質量，g。

2 結果分析

2.1 標準工作曲線的建立

按照1.3.1方法測定各個標準工作溶液的吸光度值，以L-羥脯氨酸標準工作濃度為橫坐標，以吸光度值為縱坐標建立標準工作曲線（圖1），曲線的相關系數（R2）為0.9992。

圖1 標準工作曲線

2.2 方法準確度

空白樣品和加標樣品中L-羥脯氨酸的檢測結果見表1。由于在檢測中存在各種試劑的干擾，計算加標回收率時要扣除空白樣品中L-羥脯氨酸的含量。扣除空白樣品后，在50～250 μg/g線性范圍內，加標樣品中L-羥脯氨酸的回收率在87.14%～93.09%，平均回收率為90.6%，檢出限為50 μg/g，方法準確度可以滿足檢測要求。

表1 各樣品的檢出量和回收率

表2 試驗方法的精密度結果

2.3 方法精密度

對添加量為100 μg/g的加標樣品重復測定6 次，計算檢測結果的相對標準偏差（RSD），驗證方法的精確度（表2），可以看出，重復測定結果的相對標準偏差僅為1.8%，方法的精密度符合檢測要求。

3 討論與結論

本試驗方法與原衛生部指定的測定方法相比，不需要反復移取、定容溶液，不需要每個樣品調節pH值，檢測大批量樣品時大大節省了樣品前處理時間，因此該方法適合大批量樣品的快速檢測。原衛生部指定方法的最低檢測限為100 μg/g，而本方法可以檢出添加量為50 μg/g的加標樣品中L-羥脯氨酸，且方法的準確度、精密度均可以達到檢測要求。

試驗過程中，如果所用試劑（如標準儲備溶液、標準工作曲線溶液、顯色劑）當天配制，氯胺T現用現配，檢測效果會更好。由于在檢測中存在各種試劑的干擾，因此計算加標回收率時要扣除空白樣品含量。若用本方法檢測的結果為陽性，需要用原衛生部指定方法進行復檢、定量。

[1]劉學琴，徐栓朝，高建龍，等.生鮮乳中添加皮革水解蛋白的測定方法研究.乳業科學，2010（4）：188-192.

[2]孔曉峰，古麗曼，達成彪，等.紫外分光光度法測定生鮮乳中動物水解蛋白L-羥脯氨酸含量.飼料工業，2011（4）：60-61.