生鮮乳中皮革水解蛋白（L-羥脯氨酸）檢測(cè)方法的探討

文/趙彩會(huì) 趙佳苗 田 間 賈 青

〔農(nóng)業(yè)部飼料質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心（西安）〕

2009年2月6日，原衛(wèi)生部公布了《食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)和易濫用的食品添加劑品種名單（第二批）》，其中就包括皮革水解物。皮革水解物被添加到生鮮乳中以提高蛋白質(zhì)含量。皮革水解物的檢測(cè)難度較大，而L-羥脯氨酸是其特征氨基酸，因此檢測(cè)生鮮乳中的皮革水解物，就是檢測(cè)牛奶中的L-羥脯氨酸。2009年，原衛(wèi)生部指定了其參考檢測(cè)方法是《乳與乳制品中動(dòng)物水解蛋白鑒定方法》。現(xiàn)在各監(jiān)測(cè)機(jī)構(gòu)都在用此方法。該方法的檢測(cè)步驟主要為：稱(chēng)取一定量生鮮乳，加入鹽酸，110℃水解，然后轉(zhuǎn)移、定容，從中移取少量溶液調(diào)節(jié)pH值后再定容，最后進(jìn)行氧化反應(yīng)和顯色反應(yīng)，558 nm比色測(cè)定。此方法檢測(cè)限低、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確。同時(shí)該方法也存在缺點(diǎn)，在進(jìn)行大批量樣品檢測(cè)時(shí)，過(guò)程較復(fù)雜、用時(shí)較長(zhǎng)，尤其是每一個(gè)樣品都要調(diào)節(jié)pH值。本文在該方法基礎(chǔ)上嘗試探討了一種較為簡(jiǎn)便快捷的檢測(cè)方法，即減少樣品量，并進(jìn)行充分稀釋?zhuān)∪チ苏{(diào)節(jié)pH值和反復(fù)移取、定容步驟，直接進(jìn)行氧化和顯色反應(yīng)。

1 試驗(yàn)材料和方法

1.1 主要儀器設(shè)備

分光光度計(jì)（560 nm），氮吹儀，恒溫干燥箱（110℃），水浴鍋（60℃），具塞玻璃水解管（10 mL，110℃）。

1.2 主要試劑

1.2.1 鹽酸

分析純。

1.2.2 緩沖溶液

將50 g檸檬酸、26.3 g氫氧化鈉和146.1 g結(jié)晶乙酸鈉溶于水，稀釋至1 L，再將此溶液與200 mL水和300 mL正丙醇混合。

1.2.3 氯胺T溶液

將1.41 g氯胺T溶于10 mL水中，依次加入10 mL正丙醇和80 mL緩沖溶液（1.2.2），現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.4 顯色劑

稱(chēng)取10 g對(duì)二甲氨基苯甲醛，用35 mL高氯酸溶解，緩慢加入65 mL異丙醇。

1.2.5 L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1.0 mg/mL）

稱(chēng)取100.00 mg L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品，用少量水溶解，加入1 滴6 mol/L鹽酸，再用水定容至100 mL容量瓶中，搖勻。

1.2.6 標(biāo)準(zhǔn)工作液（20.0 μg/mL）

準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1.2.5）2.00 mL于100 mL容量瓶中，用水定容，搖勻。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 測(cè)定步驟

（1）樣品處理

準(zhǔn)確稱(chēng)取生鮮乳2.00 g（精確到0.0001 g）于水解管中，加入濃鹽酸2.00 mL和2 滴50 g/L苯酚溶液，氮吹3 min，在充氮?dú)獾臓顟B(tài)下封口。將已封口的水解管放入110℃恒溫干燥箱內(nèi)，水解6 h后取出，打開(kāi)水解管，將水解液用濾紙過(guò)濾到250 mL容量瓶中，并用水反復(fù)沖洗水解管和濾紙，洗液并入容量瓶中，定容，搖勻待測(cè)。

（2）標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)溶液的配制

準(zhǔn)確吸取濃度為20.0 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)工作液0.00、2.50、5.00、7.50、10.00 mL，分別于100 mL容量瓶中，用水定容，搖勻，濃度分別為0.0、0.5、1.0、1.5、2.0 μg/mL。

（3）檢測(cè)

分別準(zhǔn)確移取配制好的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)溶液和待測(cè)水解液5.00 mL于水解管中，加入2.00 mL氯胺T（現(xiàn)用現(xiàn)配），室溫靜置20 min，再加入2.00 mL顯色劑，60℃水浴20 min。取出迅速冷卻至室溫，在560 nm波長(zhǎng)下測(cè)定樣品吸光值。

1.3.2 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

取10 支水解管，每管中準(zhǔn)確稱(chēng)量2.00 g空白生鮮乳，再分別準(zhǔn)確加入濃度為1.0 mg/mL的L-羥脯氨酸儲(chǔ)備液0、100、200、400、500 μL，2個(gè)平行，制成空白樣品和L-羥脯氨酸的添加量分別為50、100、200、250 μg/g的加標(biāo)樣品。各樣品按1.3.1測(cè)定步驟進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.3 精密度試驗(yàn)

取1.3.2中添加量為100 μg/g的樣品，按1.3.1測(cè)定步驟重復(fù)測(cè)定6 次，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.4 含量計(jì)算公式

C—從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)求得的樣品溶液L-羥脯氨酸的濃度，μg/mL；

V—樣品溶液的體積，mL；

m—樣品的質(zhì)量，g。

2 結(jié)果分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)的建立

按照1.3.1方法測(cè)定各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的吸光度值，以L(fǎng)-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度值為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)（圖1），曲線(xiàn)的相關(guān)系數(shù)（R2）為0.9992。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)

2.2 方法準(zhǔn)確度

空白樣品和加標(biāo)樣品中L-羥脯氨酸的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。由于在檢測(cè)中存在各種試劑的干擾，計(jì)算加標(biāo)回收率時(shí)要扣除空白樣品中L-羥脯氨酸的含量。扣除空白樣品后，在50～250 μg/g線(xiàn)性范圍內(nèi)，加標(biāo)樣品中L-羥脯氨酸的回收率在87.14%～93.09%，平均回收率為90.6%，檢出限為50 μg/g，方法準(zhǔn)確度可以滿(mǎn)足檢測(cè)要求。

表1 各樣品的檢出量和回收率

表2 試驗(yàn)方法的精密度結(jié)果

2.3 方法精密度

對(duì)添加量為100 μg/g的加標(biāo)樣品重復(fù)測(cè)定6 次，計(jì)算檢測(cè)結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），驗(yàn)證方法的精確度（表2），可以看出，重復(fù)測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差僅為1.8%，方法的精密度符合檢測(cè)要求。

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)方法與原衛(wèi)生部指定的測(cè)定方法相比，不需要反復(fù)移取、定容溶液，不需要每個(gè)樣品調(diào)節(jié)pH值，檢測(cè)大批量樣品時(shí)大大節(jié)省了樣品前處理時(shí)間，因此該方法適合大批量樣品的快速檢測(cè)。原衛(wèi)生部指定方法的最低檢測(cè)限為100 μg/g，而本方法可以檢出添加量為50 μg/g的加標(biāo)樣品中L-羥脯氨酸，且方法的準(zhǔn)確度、精密度均可以達(dá)到檢測(cè)要求。

試驗(yàn)過(guò)程中，如果所用試劑（如標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液、標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)溶液、顯色劑）當(dāng)天配制，氯胺T現(xiàn)用現(xiàn)配，檢測(cè)效果會(huì)更好。由于在檢測(cè)中存在各種試劑的干擾，因此計(jì)算加標(biāo)回收率時(shí)要扣除空白樣品含量。若用本方法檢測(cè)的結(jié)果為陽(yáng)性，需要用原衛(wèi)生部指定方法進(jìn)行復(fù)檢、定量。

[1]劉學(xué)琴，徐栓朝，高建龍，等.生鮮乳中添加皮革水解蛋白的測(cè)定方法研究.乳業(yè)科學(xué)，2010（4）：188-192.

[2]孔曉峰，古麗曼，達(dá)成彪，等.紫外分光光度法測(cè)定生鮮乳中動(dòng)物水解蛋白L-羥脯氨酸含量.飼料工業(yè)，2011（4）：60-61.