雌激素及其代謝產物對去勢低氧肺動脈高壓大鼠烷烴單加氧酶和低氧誘導因子-1α表達的影響

鄭泉，袁雅冬，趙靖

雌激素及其代謝產物對去勢低氧肺動脈高壓大鼠烷烴單加氧酶和低氧誘導因子-1α表達的影響

鄭泉*，袁雅冬，趙靖

目的：探討17β-雌二醇（E2）及2甲氧基雌二醇（2ME）對去勢低氧肺動脈高壓大鼠模型中烷烴單加氧酶（AlkB）和低氧誘導因子-1α（HIF-1α）的影響。

方法：選6～7周齡雌性SD大鼠60只，去勢手后采用隨機數字表法將大鼠隨機分為6組：常氧組（n=10），常氧+E2組（n=10），常氧+2ME組（n=10），低氧組（n=10），低氧+E2組（n=10），低氧+2ME組（n=10）。低氧組持續低氧（24 h，8周）；2ME組自造模之日起，每日皮下注射2ME（240 μg /kg）；E2組每日皮下注射E2（20 μg/kg）。連續飼養8周，以建立低氧性肺動脈高壓模型。測量平均肺動脈壓（mPAP）后放血處死大鼠，觀察右心室肥厚指數（RVHI），蘇木素-伊紅（HE）染色觀察肺小動脈重構情況。采用免疫蛋白印跡法、反轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）測定AlkB、HIF-1α的表達水平。

結果：與常氧組比較，低氧組大鼠肺小動脈管壁增厚管腔變窄明顯，mPAP、RVHI均顯著升高，低氧+E2組和低氧+2ME組上述形態學改變相對較輕，mPAP、RVHI均顯著高于常氧組，且低氧+E2組和低氧+2ME組間無明顯差異，常氧+E2組和常氧+2ME組肺小血管形態學無明顯變化。HIF-1α表達水平在低氧組顯著高于常氧組，低氧+E2組、低氧+2ME組亦升高，升高幅度不及低氧組，常氧+E2組、常氧+2ME組無明顯變化。AlkB表達水平在低氧組顯著低于常氧組，低氧+E2組、低氧+2ME組亦降低，降低幅度不及低氧組，常氧+E2組、常氧+2ME組無明顯變化。

結論：E2和2ME可能通過上調低氧性肺動脈高壓大鼠肺組織AlkB的表達，降低HIF-1α表達，進而緩解肺動脈高壓。

肺動脈高壓；缺氧；17β-雌二醇；2甲氧基雌二醇；低氧誘導因子-1α

Methods: A total of 60 healthy female SD rats with castrated surgery were randomly divided into 6 groups: ①Routine oxygen group, ②Routine oxygen + E2 group, the rats received subcutaneous injection of E2 (20 μg/kg·d), ③Routine oxygen + 2ME group, the rats received 2ME (240 μg/kg·d) and④Hypoxia group,⑤Hypoxia + E2 group, ⑥Hypoxia + 2ME group. n=10 in each group and all animals were treated for 8 weeks to establish the hypoxic pulmonary hypertension model. The mean pulmonary artery pressure (mPAP) was measured after bloodletting, right ventricle hypertrophy index (RVHI) was calculated and small pulmonary artery

remodeling was observed by HE staining. The expression level of HIF-1α and AlkB were examined by RT-PCR and Western blot analysis.

Results: Compared with Routine oxygen group, the rats in Hypoxia group had obviously thickened small pulmonary artery wall with narrowed lumen, increased mPAP and RVHI; the above changes in Hypoxia + E2 and Hypoxia + 2ME groups were relatively smaller, their mPAP and RVHI were higher than Routine oxygen group, while mPAP and RVHI were similar between Hypoxia + E2 and Hypoxia + 2ME groups. There were no real morphological changes in small pulmonary vessels in Routine oxygen + E2 and Routine oxygen + 2ME groups. The HIF-1α expression was obviously elevated in Hypoxia group than Routine oxygen group, while the elevation was less in Hypoxia + E2 and Hypoxia + 2ME groups. HIF-1α expression had no real changes in Routine oxygen+E2 and Routine oxygen + 2ME groups. The AlkB expression was obviously reduced in Hypoxia group than Routine oxygen group, while the reduction was less in Hypoxia + E2 and Hypoxia + 2ME groups. AlkB expression had no real changes in Routine oxygen + E2 and Routine oxygen + 2ME groups.

Conclusion: Estradiol E2 and 2ME could remit pulmonary hypertension which might be via up-regulating AlkB expression and down-regulating HIF-1α expression in experimental rats with hypoxic pulmonary hypertension.

(Chinese Circulation Journal, 2015,30:884.)

肺動脈高壓是一組以血管增殖、重構、肺血管床進行性閉塞，肺血管阻力進行性增加為特征，常導致右心衰竭。缺氧性肺動脈高壓的形成主要與早期低氧性肺血管收縮和后期肺血管重建有關。缺氧時，低氧誘導因子-1α（HIF-1α）可激活下游靶基因從而調節一系列細胞因子和生長介質的基因表達及蛋白合成，在血管反應性、血管重構以及細胞增殖等過程中發揮著重要作用。17β-雌二醇（E2）的生物活性在體內三種天然雌激素中最強，被認為起主要生理作用。近年來，雌激素對肺血管保護作用的研究日益增多，既能減輕內皮細胞和平滑肌細胞的功能損傷，又能舒張血管、改善肺血管重構，但具體機制尚未完全明了。本實驗建立去勢大鼠低氧性肺動脈高壓模型，探討E2及2甲氧基雌二醇（2ME）對低氧性肺動脈高壓大鼠模型中烷烴單加氧酶（AlkB）和HIF-1α的影響。

1 材料與方法

實驗動物及分組：6～7周雌性SD大鼠60只（河北醫科大學實驗動物中心提供，許可證編號：1312033），體重（190±10）g。行去勢手術并適應性飼養1周后采用隨機數字法將大鼠隨機分為6組：常氧組（n=10）、常氧+E2組（n=10）、常氧+2ME組（n=10）、低氧組（n=10）、低氧+E2組（n=10）、低氧+2ME組（n=10）。

主要儀器及材料：常壓低氧環境動物實驗箱（長沙長錦科技有限公司）；RM3000四導聯生理記錄儀（日本光電公司）；光學顯微鏡及照相系統（日本Olympus公司）；756MC型紫外-可見分光光度計（上海精密科學儀器有限公司）；2ME（湖北康寶泰精細化工公司）；碘[125I]-雌二醇放射免疫分析藥盒（深圳拉爾文生物工程技術有限公司）；PE-9600基因擴增儀（美國PE公司）；BioID數碼成像分析系統（法國VilberLourmat公司）；Powlab測壓軟件（美國匹茲堡AD器械有限公司）；引物由上海生物工程技術公司合成；大鼠抗HIF-1α單克隆抗體、大鼠抗alkB單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的二抗（美國Santa Cruz公司）。

模型建立：低氧組、低氧+E2組、低氧+2ME組大鼠放入低氧箱中飼養，調整低氧箱參數，保持艙內氧濃度為（10.0±0.5）%，每天持續低氧24 h，連續8周。常氧組、常氧+E2組、常氧+2ME組大鼠置于同一室內飼養。常氧+2ME組、低氧+2ME組自造模之日起，每日皮下注射2ME（240 μg /kg）。常氧+E2組、低氧+E2組每日皮下注E2（20 μg/kg）。常氧組、低氧組則每日皮下注射等量的生理鹽水。

肺動脈壓力測定：大鼠經腹腔內麻醉后，右頸縱形切口，分離出右側頸外靜脈，結扎遠心端后，作靜脈“V”形切口，經右頸外靜脈插入微導管，通過壓力傳感器連接四導生理記錄儀RM-3000連續測壓，觀察壓力波形變化來判斷導管頭端位置，待至肺動脈干后穩定10 min，隨后記錄壓力波形，計算大鼠平均肺動脈壓（mPAP）。

標本的留取：壓力測量結束后抽取大鼠頸靜脈血4 ml分別置于若干2 ml消毒EP管中，以1006.2 g離心，離心后用移液器將上清液移至2 ml消毒EP管中，放入-70℃冰箱冷凍保存。將胸腔打開取出全肺，以生理鹽水沖洗肺外表并放入潔凈玻璃皿內，

取左肺上葉制成石蠟標本觀察肺動脈形態，余肺葉待測HIF-1α、AlkB。

右心室肥厚指數（RVHI）的測定：經以上檢測后將大鼠放血處死，取出心臟置于10%中性甲醛固定48 h，沿房室溝切除心房和大血管根部，再沿至后室間溝將右心室游離壁分離，吸干水分后用電子天平分別稱取右心室和左心室+室間隔的重量，計算RVHI來反映右心室肥厚程度的變化。

大鼠肺小動脈形態學分析：將肺組織石蠟切片進行蘇木素-伊紅（HE）染色和彈性纖維染色，顯微鏡下觀察肺動脈大體形態變化。

應用反轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）測定肺組織中HIF-1α及AlkB mRNA水平：取100 mg肺組織置入勻漿器內，按Trizol法提取組織總RNA 2 μg，加入RT反應體系（含AMV Buffer、dNTPs、OligodT Primer、AMV、Rnase Inhibitor等）管中，并用焦碳酸二乙酯處理水補足至50 μl反應液體積，震蕩混勻后短暫離心，加少許礦物油于PCR儀42℃ 30 min（cDNA合成），99℃ 5 min（逆轉錄酶失活），5℃5 min。-20℃情況下保存備用。PCR擴增引物經PAGE純化。Rat AlkB的序列：上游引物 5'-GATGAAGCTCCCACAGCCAT-3'。下游引物 5'-ACAGAACAGGGCTCAAGCAA-3' 擴增片段為 188 bp。Rat HIF-1α的序列：上游引物 5'- CTCAGAGGAAGCGAAAAATGG -3'。下游引物 5'-AAT TCT TCA CCCTGCAGTAGG -3' 擴增片段為 307bp。Rat GAPDH 的序列：上游引物5'- CCTTCATTGACCTCAACTAC -3 '。下游引物5'- GGAAGGCCATGCCAGTGAGC -3 ' 擴增片段為594bp。PCR擴增條件：94℃變性3 min；（94℃ 40 s，各自的退火溫度 50 s，72℃ 90 s）× 30個循環；72℃延伸10 min。PCR產物在1%的含GV核酸染料的瓊脂糖凝膠電泳中加入的每個標本擴增產物，量為6 μl，以DNA Marker（DL2000）作為標準片段標記，電泳后在紫外透射儀下觀察，并且用數碼相機照相，輸入微機中后應用Quantity One凝膠圖象分析軟件對目的電泳條帶進行分析，把內參電泳條帶作為參照，結果以兩者之間的吸光度比值表示。

免疫蛋白印跡法（Western blot ）檢測肺組織中AlkB、HIF-1α 蛋白質的表達：取大鼠左側肺組織于 4℃用磷酸鹽緩沖液（PBS，10 mmol/L Na2HPO4，2 mmol/L KH2PO4，pH 7.4，137 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl）充分洗滌，加 5 倍體積用冰預冷的懸浮緩沖液，迅速剪碎組織，冰浴中勻漿，加入等體積的 2×SDS 凝膠加樣緩沖液，再將樣品置于沸水浴中加熱 10 min，將上清液移于另一管中為待測樣品。采用改良酚試劑法（Lowry 法）進行蛋白定量，用于免疫蛋白印跡法分析。用8%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，電轉移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上。隨即與一抗及二抗結合于室溫反應 2.5～3 h。用 TTBS液（20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，150 mmol/L NaCl）洗膜3次，每次10 min，然后用 TBS液（10 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，150 mmol/L NaCl）洗膜 1 次，約5 min。用化學發光法檢測膜上的抗原抗體結合區帶。采用VilberLourmat公司 ID 數碼成像分析軟件對免疫蛋白印跡顯色區帶的信號強度進行相對定量分析，掃描灰度值用積分光密度值（IOD）表示。

2 結果

2.1 大鼠平均肺動脈壓和右心室肥厚指數的改變（表1）

與常氧情況下大鼠比較，低氧情況下的三組大鼠mPAP明顯升高，符合肺動脈高壓的壓力水平；其中低氧組大鼠的mPAP較低氧+2ME組和低氧+E2組均明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；而低氧+2ME組與低氧+E2組比大鼠mPAP差異無統計學意義（P＞0.05）。

表1 6組大鼠體重、平均肺動脈壓和右心室肥厚指數的比較

表1 6組大鼠體重、平均肺動脈壓和右心室肥厚指數的比較

注：E2：雌激素； 2ME： 2甲氧基雌二醇。1 mmHg=0.133 kPa。與常氧組比aP＜0. 05bP＜0.01；與低氧組比cP＜0. 05dP＜0.01；與常氧+E2組比eP＜0.05；與常氧+2ME組比fP＜ 0. 05

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2.2 大鼠肺小血管及右心室形態學變化（圖1）

光鏡下，常氧組、常氧+E2組、常氧+2ME組大鼠肺動脈血管內皮細胞扁平連續，細胞分布均勻，大小厚薄一致，無細胞水腫或壞死，肺動脈管壁結構正常；而低氧組、低氧+E2組、低氧+2ME組大

鼠肺內血管壁明顯增厚，肺細小動脈中膜平滑肌細胞增多，中膜增厚，管腔變窄；低氧+E2組及低氧+2ME組肺動脈管壁結構介于常氧組和低氧組之間。各組右心室肥厚指數的變化趨勢同mPAP變化。

圖1 6組大鼠肺組織形態和病理變化（×100）

2.3 大鼠肺組織中HIF-1αmRNA及AlkBmRNA表達水平變化（圖2、表2）

低氧組大鼠HIF-1αmRNA表達水平顯著高于常氧組，低氧+E2組、低氧+2ME組亦升高，升高幅度不及低氧組，常氧+E2組、常氧+2ME組無明顯變化。AlkBmRNA表達水平在低氧組顯著低于常氧組，低氧+E2組、低氧+2ME組亦降低，降低幅度不及低氧組，常氧+E2組、常氧+2ME組無明顯變化。

表2 6組大鼠肺組織中HIF-1αmRNA和AlkBmRNA表達水平

表2 6組大鼠肺組織中HIF-1αmRNA和AlkBmRNA表達水平

注：AlkB：烷烴單加氧酶；HIF-1α：低氧誘導因子-1α。與低氧組比aP＜0. 05bP＜0.01；與低氧+E2組比cP＜0.05dP＜0.01；與低氧+2ME組比eP＜0. 05fP＜0.01。余注見表1

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2.4 大鼠肺組織中HIF-1α及AlkB蛋白表達水平的變化（圖3、表3）

低氧組HIF-1α蛋白表達水平顯著高于常氧組，低氧+E2組、低氧+2ME組亦較常氧組升高，但升高幅度不及低氧組，常氧+E2組、常氧+2ME組與常氧組比較無明顯變化。低氧組AlkB蛋白表達水平顯著低于常氧組，低氧+E2組、低氧+2ME組較常氧組亦降低，降低幅度不及低氧組，常氧+E2組、常氧+2ME組與常氧組比較無明顯變化。

圖3 6組大鼠肺組織中低氧誘導因子-1α蛋白和烷烴單加氧酶蛋白的免疫印跡圖

表3 6組大鼠肺組織中低氧誘導因子-1α蛋白和烷烴單加氧酶蛋白表達水平

表3 6組大鼠肺組織中低氧誘導因子-1α蛋白和烷烴單加氧酶蛋白表達水平

注：與低氧組比aP＜ 0.05bP＜0.01；與低氧+E2組比cP＜0.05dP＜0.01；與低氧+2ME組比eP＜0.05fP＜0.01。余注見表1

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3 討論

肺動脈高壓的主要病理變化為肺動脈收縮反應增強及以平滑肌細胞增生為主要特征的肺血管結構

重建[1]。缺氧性肺動脈高壓的形成主要與低氧性肺血管收縮和肺血管重構相關。HIF-1α是一種隨胞內氧濃度變化而調節基因表達的轉錄激活因子，其活化后，能激活如血管內皮生長因子等40種調控代謝、細胞遷移和血管生成的蛋白信號。常氧時HIF-1α蛋白的氧依賴性降解功能區調節HIF-1α與希佩爾—林道病腫瘤抑制蛋白作用，后者能識別泛素化連接酶E3導致HIF-1α發生泛素化降解[2]。缺氧時HIF-1α不能被希佩爾—林道病腫瘤抑制蛋白識別從而無法被泛素化降解，其表達量在細胞內呈指數式增加[3]。

本研究顯示在去勢和低氧并存條件下，無論右心室及肺血管形態學還是mPAP等均變化較大，且肺組織中HIF-1α的表達呈明顯升高趨勢；推測缺氧是肺動脈高壓發展的始動因素，而雌激素的缺失加劇低氧所致肺動脈高壓。給予E2及2ME干預后右心室及肺動脈管壁結構發生逆轉，肺組織中HIF-1αmRNA表達水平明顯低于低氧組。Miyamoto等[4]研究發現，E2在低氧時呈劑量、時間依賴性降低肺組織中HIF-1α的表達。研究認為雌激素對HIF-1α的影響可通過其受體介導和下游代謝產物2ME來發揮作用，E2通過與受體結合具有促進細胞外信號調節蛋白激酶和p38絲裂原活化蛋白激酶磷酸化、下調細胞周期素依賴性蛋白激酶抑制蛋白、刺激內皮細胞遷移及增殖及抑制內皮細胞凋亡等作用[5-8]。此外，植物雌激素對氧感受信號具有調制作用，通過作用與細胞內自由基，影響細胞內各種信號傳導途徑從而下調HIF-1α的表達[9]。

2ME由雌二醇2位碳原子先羥化再甲基化形成；對雌激素受體的親和力較低[10]。有學者采用在低氧下培養HEK293細胞，發現經2ME處理后可顯著降低HIF-1α的轉錄活性，推測其抑制HIF-1α的功能是通過促進HIF-1α蛋白降解[11]。也有觀點認為經2ME作用后，HIF水平降低是由于HIF-1α合成受抑制[12]，研究者們普遍認為2ME是不通過雌激素受體而獨立發揮對HIF-1α的拮抗作用。外源性雌激素進入機體后約80%經17β脫氫酶氧化為雌酮或硫酸雌酮，僅約20%可能轉化為雌三醇、2ME等。缺氧以及氧化應激又進一步下調2-羥基化通路關鍵酶2-CYP1A1/2的表達，導致E2轉化為2ME減少。故缺氧時2ME所發揮的抑制HIF-1α作用將被減弱。本研究中未觀察到上述現象，推測2ME對HIF-1α的抑制作用不存在類似E2的時間、劑量依賴性，這進一步提示二者的作用機制不同。達到一定濃度后，2ME對HIF-1α的抑制作用將與濃度無關。

缺氧時胞漿內HIF-1α發生核移位與核內HIF-1β 結合，調控相關基因的轉錄。本研究觀察到大鼠肺組織中ALKBmRNA及蛋白水平與HIF-1α的增加存在著一定的關系。AlkB為單核非血紅素Fe2+和α-酮戊二酸依賴的雙加氧酶超家族成員，通過激活雙氧分子催化氧化與穩定雜環上氮原子相接觸的甲基團，使之構象發生改變，從而以釋放甲醛的形式移除甲基團。低氧使AlkB表達下調，致其修復DNA和RNA異常甲基化的能力有所下降從而導致HIF-1α的活性增加[13]。E2、2ME干預作用是否通過HIF-1α為介質來發揮對AlkB的影響尚需進一步研究證實。

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Effect of Estradiol and its Metabolite on Hypoxic Induced Factor-1αand Alkane Hydroxylase in Experimental Rats With Ovariectomy and Hypoxic Pulmonary Hypertension

ZHENG Quan, YUAN Ya-dong, ZHAO Jing.
Department of Respiratory and Critical Care Medicine, The Second Hospital, Hebei Medical University, Shijiazhuang (050000), Hebei, China

Objective: To explore the effects of 17 β-estrogen (E2) and 2-methoxyestradiol (2ME) on hypoxic induced factor-1α (HIF-1α) and alkane hydroxylase (AlkB) in experimental rats with ovariectomy and hypoxic pulmonary hypertension.

Pulmonary hypertension; Anoxia; 17 β-estrogen; 2-methoxyestradiol; Hypoxia induced factor-1

2015-01-28）

（編輯：許 菁）

河北省自然科學基金（H2013206403）

050000 河北省石家莊市，河北醫科大學第二醫院 呼吸與危重癥醫學科

鄭泉 主治醫師 碩士 主要從事肺血管病研究 Email：xk9032@163.com*現就職于武漢市第三醫院呼吸內科 通訊作者：袁雅冬

Email：yyd1108@126.com

R54

A

1000-3614（2015）09-0884-05

10.3969/j.issn.1000-3614.2015.09.015