來源于HIV-1 gp120 V3區的多肽誘導PC12細胞凋亡的初步研究

夏承來，陳銳洪

（廣州醫科大學附屬第三醫院藥學部，廣東廣州510150）

來源于HIV-1 gp120 V3區的多肽誘導PC12細胞凋亡的初步研究

夏承來，陳銳洪

（廣州醫科大學附屬第三醫院藥學部，廣東廣州510150）

目的研究HIV-1 gp120 V3區多肽誘導神經細胞凋亡中的機制。方法體外培養大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞（PC12細胞），采用Annexin V聯合細胞周期與細胞凋亡檢測試劑盒（PI）法結合流式細胞術檢測細胞的凋亡；獲得細胞凋亡模型后，采用Western blotting研究不同濃度（0、100、200、400、800 nmol/L）來源于gp120的多肽處理細胞以及400 nmol/L多肽在不同時間（0、4、12、24、36、48 h）對PC12細胞PLK-1表達的影響。結果HIV-1 gp120 V3區多肽誘導PC12細胞凋亡后，Polo樣激酶1的表達降低，并呈現濃度-時間依賴性。結論HIV-1 gp120 V3區多肽誘導PC12細胞凋亡與PLK-1有關。

細胞凋亡；Polo樣激酶1；獲得性免疫缺陷綜合征/流行病學；獲得性免疫缺陷綜合征/預防和控制；HIV包膜蛋白質gp120

HIV腦?。℉AD）又稱為獲得性免疫缺陷綜合征（AIDS）癡呆綜合征[1]，是中國AIDS患者致畸和致死的主要原因[2]。雖然高效抗反轉錄病毒治療（HAART）在治療HIV感染方面取得一定效果，但近年來精細認知和運動障礙（MCMD）的發病率逐年上升，成為AIDS致死的獨立因素，說明HAART在干預HAD的發病方面仍具有局限性[3-4]。目前用于臨床抗HIV-1藥物有以下4類：蛋白酶抑制劑、融合抑制劑、反轉錄酶抑制劑及整合酶抑制劑[5-6]。但由于血-腦脊液屏障阻斷藥物的滲透，藥物對神經系統并無較好的保護作用，因此HIV-1對中樞神經系統的慢性感染仍然無法控制。反之，由于HAART能使患者生存期延長，導致的最終結局將是HAD的發病率不斷上升。因此尋找新的抗HAD的藥物靶點是當前AIDS防治研究的熱點[7]。

Polo樣激酶（PLKs）是人體中一類高度保守的絲/蘇氨酸蛋白激酶，在大多數人的腫瘤細胞中，PLKs呈過表達狀態[8]。PLK1蛋白的第326位絲氨酸被依賴MAPK激活的蛋白激酶2（MK2）磷酸化后，參與調控p38 MAPK信號通路[9]。并且gp120可導致離體大鼠神經元的p38和c-JNK的磷酸化和激活caspase-3[10]。HIV-1 tat通過其結合蛋白Tip60與cyclin B1、PLK1形成復合物，導致細胞有絲分裂障礙，提示PLK可能參與了HIV-1感染的過程[11]。在本課題中，作者研究了在HIV gp120 V3區來源的多肽誘導PC12細胞凋亡中PLK1的表達情況，為尋找HAD新的藥物靶點提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料根據參考文獻[12]，HIV-1 gp120 V3區多肽由上海楚肽生物公司合成。多肽序列如Asn-Asn-Thr-Arg-Lys-Ser-Ile-Arg-Ile-Gln-Arg-Gly-Pro-Gly-Arg-Ala-Phe-Thr-Ile-Gly-Lys-Ile-Gly。兔抗人PLK-1抗體購自Cell Signal公司。β-actin和二抗均購自BD Pharmingen公司。Hoechst 33342和碘化丙啶（PI）染料購自美國Sigma公司。胰蛋白酶[不含乙二胺四乙酸（EDTA）]、磷酸鹽緩沖液（PBS）、細胞凋亡檢測試劑盒均購自天津灝洋生物公司。細胞裂解緩沖液、1×SDS凝膠加樣緩沖液、聚丙烯酰胺預制膠、聚偏二氟乙烯膜（PDVF）膜、辣根過氧化物酶、TBST緩沖液、蛋白質印跡熒光檢測試劑盒均購自廣州展晨生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞（PC12細胞）為本研究室保留所得。細胞復蘇后，在37℃、5% CO2條件下培養，細胞培養液為DMEM完全培養基[含10%胎牛血清（FBS）]。用無血清的培養基培養細胞24h，使細胞生長同步化，然后用藥物處理48 h，用于后續實驗。

1.2.2 細胞凋亡及細胞壞死的檢測采用鈣依賴性磷脂結合蛋白V（Annexin V）聯合細胞周期與細胞凋亡檢測試劑盒（PI）法結合流式細胞術檢測細胞的凋亡。具體如下：用不含EDTA的胰蛋白酶消化收集PC12細胞；用PBS洗滌細胞2次（2 000 r/min離心5 min）收集1×105～5×105μL-1細胞；加入500 μL Binding Buffer懸浮細胞；加入5 μL Annexin V-FITC混勻后，加入5 μL碘化丙啶（PI），混勻；室溫、避光、反應5～15 min；在1 h內進行流式細胞儀的觀察和檢測；用流式細胞儀檢測，激發波長Ex=488 nm；發射波長Em=530 nm。Annexin V-FITC的綠色熒光通過FITC通道檢測；PI紅色熒光通過PI通道檢測。使用未經凋亡誘導處理的正常細胞，作為對照進行熒光補償調節去除光譜重疊和設定十字門的位置。

1.2.3 蛋白質免疫印跡分析收集細胞，加入細胞裂解緩沖液，細胞發生裂解后將細胞裂解液于4℃溫度下離心10 min，去除沉淀。蛋白質定量方法為BCA法，吸取蛋白質30 μg加入1×SDS凝膠加樣緩沖液中，在100℃溫度下加熱10 min，蛋白質發生變性之后，以聚丙烯酰胺凝膠進行電泳、分離，轉入PDVF膜中，以適量5%脫脂牛奶封閉2 h，按1∶10 000加入一抗（兔抗人PLK1抗體或內參β-actin抗體），在4℃的孵育箱中孵育過夜，用TBST緩沖液洗滌3次，每次15 min；然后按1∶10 000加入辣根過氧化物酶標記二抗，在室溫下孵育1 h，用TBST緩沖液洗滌3次，每次15 min。按照試劑盒所附說明進行操作，用蛋白質印跡熒光檢測試劑盒顯示于X光膠片上。X光片曝光結果用Geniu凝膠圖像分析系統進行掃描，定義對照組測得的面積灰度值為100%，與實驗組進行比較和半定量分析。

1.3 統計學處理應用SPSS13.0統計軟件進行數據分析，計量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗，兩變量之間的相關性采用Spearman秩相關分析法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 來源于gp120的多肽誘導PC12細胞凋亡模型的建立參照文獻[13]方法，在細胞凋亡早期位于細胞膜內側的磷脂酰絲氨酸（PS）遷移至細胞膜外測。Annexin V與PS具有高度的結合力。因此，Annexin V可以作為探針檢測暴露在細胞外側的磷脂酰絲氨酸。所以將Annexin V標記上Annexin V-FITC，同時結合使用PI拒染法進行凋亡細胞雙染后，用流式細胞儀即可檢測凋亡細胞數。作者用不同濃度的gp120多肽（0、50、100 nmol/L）誘導PC12細胞48 h，采用Annexin V-PI法結合流式細胞術分析凋亡細胞情況。結果顯示，正?；罴毎鸄nnexin V、PI均低染；凋亡細胞AnnexinV高染、PI低染；壞死細胞AnnexinV/PI均高染。按上述多肽濃度排列分析凋亡細胞百分率為（1.97±0.21）%、（11.22±0.85）%和（84.89±2.45）%。經分析，100 nmol/L處理組的凋亡細胞百分率（84.89± 2.45）%顯著高于0 nmol/L處理組（1.97±0.21%），差異有統計學意義（P＜0.01，n=3）；說明100 nmol/L來源于gp120的多肽可以誘導出PC12細胞凋亡模型（圖1A～C）。

圖1 gp120多肽誘導PC12細胞凋亡

2.2 PLK1在不同濃度多肽誘導PC12凋亡中的表達情況不同濃度的gp120多肽（0、100、200、400、800 nmol/L）處理PC12細胞48 h后，提取細胞總蛋白，檢測PLK1蛋白表達情況。PLK1的表達降低，并呈濃度依賴性（圖2）。

圖2 不同濃度的gp120多肽對細胞PLK1蛋白表達影響（n=3）

2.3 PLK1在gp120多肽處理PC12細胞不同時間中的表達情況gp120多肽（400 nmol/L）處理PC12細胞不同時間（0、4、2、24、36、48 h）后，提取細胞總蛋白，檢測PLK1蛋白表達情況。PLK1的表達降低，并呈時間依賴性，見圖3。

圖3 gp120多肽對細胞PLK1表達的影響（n=3）

3 討論

HIV侵入大腦引起神經細胞凋亡導致HAD的機制并不清楚。HIV-1胞膜蛋白gp120是迄今為止研究較多的神經毒性物質之一。gp120通過與靶細胞膜上的CD4結合，促使gp120發生構象改變，暴露出內部隱藏的與輔助受體結合的區域CXCR4或CCR5，參與HIV-1感染宿主細胞的過程[14]，發揮直接致神經損傷的毒性作用，導致學習記憶的損傷。對過度表達gp120的轉基因小鼠的研究發現實驗，神經元的損傷程度與gp120的表達成比例[15]。在病毒侵入中樞神經的過程中，來源于gp120 V3環的多肽可以抑制長時程增強，其與突觸可塑性密切相關[16]。HIV-1感染的大腦后，gp120從感染細胞上脫落，或從感染的單核巨噬細胞中分泌出來，可造成神經元的損傷，導致認知障礙，參與HAD的病理過程[17]。

對PLKs的分子結構研究發現，此類蛋白激酶N端具有一個高度同源的絲/蘇氨酸激酶結構域，而C端的特征性結構域具有調節PLKs活性、亞細胞動態定位功能。目前已知PLKs具有較多的家族成員，在人體內主要分為PLK1、PLK2、PLK3和PLK4 4種亞型，PLKs在人類細胞周期各個時相的調控中均發揮著重要作用。PLK1在人體正常細胞中具有較低表達水平，甚至難以測出，而在多種腫瘤癌組織中，PLK1過表達則被認為是腫瘤不良預后的標志之一。Jayadev等[18]提出，高活性PLK1（即Thr210 Asp突變體）在體內表達可誘使細胞周期越過DNA損傷所導致的G2期停滯的檢查點，由此促使細胞分裂，且在PLK1作用下可引起p53基因發生磷酸化，p53基因將喪失其誘導腫瘤細胞凋亡的作用。

PC-12細胞株來源于一種可移植的大鼠嗜鉻細胞瘤，該細胞對神經生長因子有可逆的神經元顯性反應，廣泛用于神經系統疾病的體外研究。在本研究中，用gp120 V3區多肽誘導PC12細胞凋亡，發現PLK1的表達水平下降，并呈時間-濃度依賴性，說明該蛋白參與了HIV-1誘導神經細胞的過程。作者將進一步深入研究PLK1參與HAD發病的具體機制，期望尋找HAD新的藥物靶點。

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本刊編輯部

Initial study on polypeptide-induced PC12 cell apoptosis in the area of HIV-1 gp120

Xia Chenglai，Chen Ruihong
（Department of Pharmacy，the Third affiliated Hospital，Medical University of Guangzhou，Guangzhou，Guangdong 510150，China）

Objective To study the mechanism of polypeptide-induced PC12 nervous cell apoptosis in the area of HIV-1 gp120.Methods The adrenal gland chromaffin tumor cell（PC12）by cultivation in vitro was detected the apoptosis by Annexin V combined with PI and flow cytometry.Obtaining the model of cell apoptosis，it adopted Western blotting to inspect the polypeptide-disposed cells from gp120 with the concerntrations of 0，100，200，400 and 800 nmol/L and the influence on PC12 cells′PLK-1 expression of 400 nmol/L polypeptide at the time of 4th，12th，24th，36th，48th hour.Results After the apoptosis of polypeptide-induced PC12 cells，The expression of polo-like kinases-1 was decreased and demonstrated dependence of concentrationtime.Conclusion The apoptosis of polypeptide-induced PC12 cells in the area of HIV-1 gp120 V3 is involved in PLK-1.

Apoptosis；Polo sample kinase 1；Acquired immunodeficiency syndrome/epidemiology；Acquired immunodeficiency syndrome/prevention&control；HIV envelope protein gp120

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.03.004

A

1009-5519（2015）03-0329-03

2014-10-10）

廣東省醫學科研基金資助項目（省衛生廳A2012273）；廣東省科技計劃（粵科規財字[2014]116號2013B021800188）。

夏承來（1977-），男，湖南邵陽人，博士研究生，副教授，主要從事病毒免疫學和抗病毒藥物治療學的研究；E-mail：xiachenglai@126.com。