超聲處理條件對血橙皮渣中黃酮類物質的影響*

朱攀攀，馬亞琴，竇華亭，胡中海，2，汪志濤，韓智

1(西南大學 柑橘研究所，重慶，400712)2(西南大學食品科學學院，重慶，400715)

血橙屬于臍橙類，具有色澤、風味、營養等均俱佳的特點，既適鮮食，又可用于生產加工，深受廣大消費者的青睞［1］。食用后的血橙皮占果實的1/3，常作為廢棄物被丟棄，不僅浪費資源，且造成環境的污染［2］。黃酮類化合物是一類重要的植物次級代謝產物，其中蕓香柚皮苷和橙皮苷是血橙中主要的黃酮類物質［3］，但血橙皮渣中橙皮苷的含量遠高于蕓香柚皮苷的，相差幾倍至幾十倍，甚至百倍，這可能與地區和品種相關，如批次(20110818013)枳物2種黃酮類化合物相差近20倍［4］。同時它們具有抗氧化、預防心血管疾病［5］、抗衰老、降血糖、增強機體免疫力等作用，還具有防癌抗癌療效［6-7］。因此，對血橙皮的開發利用意義重大，既有利于資源再生又可保護環境。

超聲波是一種彈性機械振動波，它能產生強烈振動，產生高速度、強烈的空化效應，能破壞植物細胞，加速溶劑滲透到植物細胞內，促使液-固之間發生分子的相互滲透，進而促進有效成分的溶解，加快有效成分進入介質［8-10］。目前黃酮類化合物的提取方法主要有堿性稀醇或堿性水、有機溶劑、超濾、超聲波、微波和酶法等［11］。已有研究表明，超聲波提取法具有提取時間短、效率高、低溫等優點［12］，近年來已廣泛用于黃酮類化合物及其他天然活性成分的提取，如紅棗核、銀杏葉、山楂、艾葉等總黃酮的提取及多糖的提取等。郝云彬等［13］利用超聲波技術在橘皮中提取了橙皮苷，認為甲醇作為提取溶劑更有利于橙皮苷的溶出;Ma等［14］研究了超聲波輔助提取對椪柑皮中橙皮苷含量的影響，結果表明提取溶劑、超聲頻率和提取溫度對橙皮苷提取率均產生顯著性影響;隨后黃運紅等［15］也利用超聲波提取了臍橙皮中的黃酮類化合物，得出了超聲波提取具有工藝簡單，操作方便且對環境無污染等優點;王華等［16］運用超聲波輔助乙醇提取了柑橘皮渣發酵液的總黃酮，得出料液比和超聲時間的交互項對總黃酮提取率影響顯著，其他均不顯著;張玉等［17］利用響應面法優化柑橘皮渣中類黃酮的超聲波提取工藝研究，發現采用新鮮柑橘皮渣更有利于類黃酮的提取;劉蓉等［18］應用超聲波法對塔羅科血橙皮中黃酮類化合物進行了相關研究，他們在單因素的基礎上利用正交試驗得到了最佳提取工藝:1∶35(g∶mL)的料液比、提取溫度50℃、溶劑的體積分數50%、超聲時間40 min，超聲波功率400 W時提取率可達1.021 3%，各因子對黃酮類化合物提取率影響的主次順序遞減的。但就血橙皮渣中主要的黃酮類物質蕓香柚皮苷和橙皮苷的同時提取鮮有報道。

本研究采用超聲波輔助提取血橙皮渣中的蕓香柚皮苷和橙皮苷，進而有效提取血橙皮渣中黃酮類化合物。

1 材料與方法

1.1 試驗原料與試劑

血橙皮渣，西南大學柑桔研究所中試車間榨汁所得，50℃烘干。粉碎過篩得到粒徑為80目的樣品，置于玻璃干燥皿上備用;

甲醇，冰乙酸，均為分析純，均購自于成都市科龍化工試劑廠;蕓香柚皮苷標準品、橙皮苷標準品，純度均為≧95.5%，均購自Sigma公司。

1.2 試驗儀器和設備

超聲波清洗器 DP-800，上海生析超聲儀器有限公司;電子分析天平 FAZ004B，上海精密儀器有限公司;高效液相色譜儀 ultimate3000，戴安中國有限公司;氮吹儀TTL-DCI，北京同泰聯科技發展有限公司;

1.3 實驗方法

1.3.1 黃酮含量的測定

1.3.1.1 標準曲線的制作

采用高效液相色譜測定蕓香柚皮苷和橙皮苷的含量。檢測條件［19］:色譜柱為Thermo Fisher色譜柱(5 μm，100 A，4.6 mm ×250 mm，柱溫 30 ℃，V(1%冰乙酸)∶V(甲醇)=60∶40，流速1.000 mL/min，進樣量20.000 μL，紫外檢測波長為283 nm。

標準曲線的繪制:分別準確稱取0.005 g和0.018 0 g的蕓香柚皮苷和橙皮苷標準品，體積分數(下同)80%甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶中作為母液，將以上母液分別稀釋成不同的稀釋度，以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。

表1 蕓香柚皮苷和橙皮苷的線性方程和相關系數Table 1 Linear equations and correlation coefficients of narirutin and hesperidin

1.3.1.2 黃酮含量的測定

樣品制備:取經前處理的血橙皮渣粉末，按料液比1∶40(g∶mL)加入80%的甲醇，超聲功率的60%即480 W提取40 min后，精確取1 mL提取液置于氮吹儀蒸發濃縮至干并用1 mL 50%的甲醇溶解，備用，按以上檢測條件定量測量。采用外標法定量計算蕓香柚皮苷和橙皮苷的含量。

1.3.2 實驗設計

準確稱取1 g的血橙皮渣粉末，80%甲醇為提取溶劑，分別考察了料液比、超聲波提取時間、超聲波提取溫度、超聲波功率對黃酮含量的影響。(1)料液比。選擇 1∶20、1∶30、1∶40、1∶50(g∶mL);(2)超聲波提取時間。分別在20、30、40、50、60 min 處理;(3)超聲波提取溫度。分別為31、40、50、60℃提取血橙皮渣中的兩種黃酮類物質;(4)超聲波功率。在25 kHz和60 kHz的頻率下，分別以 160、320、480、640、800 W的超聲功率為單因素，超聲處理后，處理液過濾，濾液備用待測。

1.3.3 數據分析

數據以excel和origin9分析軟件結合進行相關分析。

2 結果與討論

2.1 料液比對血橙皮渣中黃酮類物質含量的影響

本研究的料液比指血橙皮渣粉末的質量與提取溶劑甲醇體積之比(g∶mL)。由圖1可知。蕓香柚皮苷和橙皮苷隨料液比的變化其含量變化規律相似，但有所差異。蕓香柚皮苷在1∶40時含量最高，而橙皮苷的含量呈現出繼續增加的趨勢，這可能由于蕓香柚皮苷和橙皮苷對提取溶劑的極性本身存在差別［14］，橙皮苷與80%的甲醇極性更為相當，隨提取溶劑體積的增加橙皮苷更有利于溶出，所以其含量持續增加，但增幅變小。此外，料液比增加同樣會加速物料中的其他成分溶解，進而影響蕓香柚皮苷和橙皮苷的提取量。比較2種黃酮含量的變化，考慮到提取效果和經濟效益，選擇1∶40的料液比較為合適。這與Yang等［20］利用超聲波從四棱樹中提取蘆丁和槲皮素的研究中得出了相似的結論。

圖1 料液比對血橙皮渣中蕓香柚皮苷和橙皮苷含量的影響Fig.1 Effects of solid-liquid ratio on yields of narirutin and hesperidin from blood orange peels using 80%methanol with 480 W for 40 min at 50℃

2.2 提取時間對血橙皮渣中黃酮類物質含量的影響

超聲波處理時間對血橙皮渣中黃酮類化合物的影響如圖2所示。由圖2可知，2種黃酮類物質隨著提取時間的增加有相似的變化規律。隨著提取時間的延長，2種黃酮物質含量先增加后減小，50 min后出現1個突變。40 min之前，2種黃酮含量迅速增加，30～40 min時增幅變小。主要原因在于處理時間較短時細胞內外溶質的濃度差比較大，存在較明顯的濃度梯度，為黃酮類物質的溶出提供一定動力，同時在超聲波的作用下，兩類黃酮化合物能快速從細胞溶出。但隨著處理時間的延長，由于超聲波產生的大量熱和空化效應，可能對2種黃酮類化合物的結構有所破壞［19，21］，導致黃酮含量下降。在 50 ～60 min 又呈現緩慢的上升趨勢，這可能由于隨著提取時間的延長和周圍環境溫度的提高，2種黃酮類物質被提取的同時，又被溶劑溶解而發生了降解反應［21］使黃酮含量增幅變緩。綜合比較2種黃酮物質的變化趨勢可知，提取時間為40 min時較為合適，張玉等［17］在利用響應面法優化柑橘皮渣中類黃酮的超聲波提取工藝研究中得到相同的結果。

圖2 不同提取時間對血橙皮渣中蕓香柚皮苷和橙皮苷含量的影響Fig.2 Effect of ultrasonic treatment time on the yields of narirutin and hesperidin from blood orange peels using 80%methanol with 480 W at 50℃

2.3 提取溫度對血橙皮渣中黃酮類物質含量的影響

提取溫度對血橙皮渣中黃酮類物質的影響如圖3所示。

圖3 不同提取溫度對血橙皮渣中蕓香柚皮苷和橙皮苷含量的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on yields of narirutin and hesperidin from blood orange peels using 80%methanol with 480 W for 40 min

由圖3可知，隨溫度的升高，2種黃酮的含量先增大后降低，且橙皮苷對溫度的變化趨勢更為明顯。提取溫度從30℃升高到50℃，黃酮含量迅速升高，主要在于溫度升高能加快體系分子的運動速度，有利于黃酮類化合物向溶劑中擴散。當溫度高于50℃時，兩類黃酮含量略有下降，因為溫度過高時提取出的黃酮類化合物的結構被破壞，從而使兩類黃酮含量降低［22-23］。綜合經濟效益、黃酮產率等因素，50℃的提取溫度對血橙皮渣中2種黃酮類化合物的提取效果較好。

2.4 超聲功率對血橙皮渣中黃酮類物質含量的影響

超聲技術近年來在食品領域的應用日益廣泛，根據其能量強度可分為兩大類［24-25］:高頻低能超聲和低頻高能超聲。高頻低能超聲指能量低于1 W/cm2而頻率高于100 kHz的超聲波，主要用于無損檢測和食品材料中物理化學特性的診斷，獲得食品組成、質構、流變學性質等。低頻高能超聲則指能量高于1 W/cm2而頻率低于100 kHz的超聲波，能產生較大的空穴效應，機械效應和熱效應。本研究所采用的超聲波為定制的低頻高能超聲波，基于前期的實驗結果［14］，即超聲頻率低于100 kHz時提取效果更理想，此外，考慮到單臺超聲波設置多個超聲頻率可能影響實際提取效率，設定的超聲頻率分別為25 kHz和60 kHz。

2.4.1 25 kHz超聲條件下超聲功率對黃酮類化合物的影響

圖4 25 kHz條件下超聲功率對血橙皮渣中蕓香柚皮苷和橙皮苷含量的影響Fig.4 Effect of ultrasonic power on yields of narirutin and hesperidin from blood orange peels using 80%methanol with frequency of 25 kHz for 40 min at 50℃

由圖4可知，2種化合物的含量變化在試驗范圍內隨著超聲波功率的增大而升高，這主要因為功率的增大使超聲波表現出的機械效應，空化效應都顯著增加，加快了黃酮化合物的溶出。當超聲波功率由160 W升高至320 W，2種黃酮化合物的含量的增加幅度較大。由320 W至800 W，其含量增加的幅度較小。原因可能由于超聲功率越大轉化為熱損耗的和散射的能量越多，從而進入組織內部的能量相對減少［14］。同時，為提高黃酮的溶出，后續試驗采用480 W的超聲波功率提取血橙中的黃酮類化合物。劉蓉等［18］利用超聲波提取了塔羅科血橙皮中黃酮類化合物，研究結果同樣認為480 W的超聲功率較為合適。

2.4.2 60 kHz超聲條件下超聲功率對黃酮化合物的影響

選擇60 kHz的超聲頻率，所得血橙皮渣中黃酮類化合物的含量如圖5所示。

圖5 60 kHz條件下不同提取功率對血橙皮渣中蕓香柚皮苷和橙皮苷含量的影響Fig.5 Effect of ultrasonic power on yields of narirutin and hesperidin from blood orange peels using 80%methanol with frequency of 60 kHz for 40 min at 50℃

由圖5可知，60 kHz超聲頻率下，超聲處理得到2種黃酮類化合物的變化趨勢與25 kHz超聲頻率下(圖4)得到的基本相同。但不同之處在于蕓香柚皮苷在480 W時，其黃酮含量沒有增加反而略微下降。此外，25 kHz的超聲頻率下處理得到的2種黃酮類物質的含量整體高于60 kHz的。表明在本研究條件下，25 kHz的超聲頻率更有利于黃酮類物質的提取。Lorimer等［26］研究報道了隨著超聲頻率的增加空穴氣泡反而減小，表明低頻高能超聲(16～100 kHz)產生了較大的空穴強度，并隨著頻率的增加空穴強度逐漸減弱。另外，超聲功率在超聲波提取過程中是非常重要的一個參數，前期的研究表明［27］，超聲功率隨著超聲波傳播距離的增加而發生衰減從而引起提取率的降低，以及各超聲參數之間的互作效應對提取結果可能產生影響，這方面正在開展進一步的研究。同樣考慮到黃酮含量的高低、經濟效益等因素，后續試驗仍采用480 W的超聲波功率提取血橙中的黃酮類化合物。

3 結論

(1)本實驗得出以體積分數80%甲醇為提取溶劑的條件下，超聲波輔助提取血橙皮渣中的蕓香柚皮苷和橙皮苷的最佳工藝為:物料比1∶40(g∶mL)，超聲波處理時間40 min、提取溫度50℃、超聲波功率為480 W，超聲頻率為25 kHz。

(2)與超聲波輔助提取血橙皮渣中總黃酮的最佳工藝［17］比較，在選擇提取溶劑的體積分數存在較大差別，本文采用體積分數80%的甲醇對橙皮苷和蕓香柚皮苷的進行了提取，而總黃酮的提取采用的是體積分數50%的乙醇為提取溶劑;此外，超聲因素料液比對黃酮類物質影響的程度也存在差異。

(3)通過本研究得到超聲波提取溫度和時間對血橙皮渣中蕓香柚皮苷和橙皮苷含量的影響最為顯著，血橙皮渣中本身橙皮苷和蕓香柚皮苷的含量差異較大［4，28］，同時為在同一條件下比較研究，故選用了相同的提取條件。25 kHz超聲頻率下處理比60 kHz超聲頻率更有利于黃酮類物質的提取。超聲參數主要通過增強或減弱超聲波的空化效應對蕓香柚皮苷和橙皮苷的提取量產生影響，其次，熱效應和機械效應也可能產生一定的輔助作用。此外，研究發現各超聲參數對血橙皮渣中2種黃酮類物質提取量的影響都較為顯著，表明超聲波應用于提取柑橘皮渣中的黃酮具有潛在的應用價值。對于各超聲參數間可能存在的協同交互作用，這方面的研究有待于進一步深入開展。

［1］ 蘇學素，焦必寧，陳宗道，等.超濾對血橙果汁中抗氧化成分及總抗氧化能力的影響［J］.農業工程學報，2004，20(2):185-188.

［2］ 卓莉，阮尚全，鄧紅英.雙水相法提取血橙渣中黃酮類化合物的研究［J］.赤峰學院學報:自然科學版，2012(18):17-18.

［3］ 曹少謙，陳偉.血橙中花色苷及黃酮類物質的結構鑒定［J］.浙江萬里學院學報，2010，23(6):69-75.

［4］ 朱露，雷鵬，黃琪，等.反相高效液相色譜法測定枳實中蕓香柚皮苷，柚皮苷，橙皮苷，新橙皮苷的含量［J］.中南藥學，2013(12):934-937.

［5］ Londo?o-Londo?o J，Lima V R，Lara O，et al.Clean recovery of antioxidant flavonoids from citrus peel:Optimizing an aqueous ultrasound-assisted extraction method［J］.Food Chemistry，2010，119(1):81-87.

［6］ 史清文，劉素云，張文素，等.銀杏葉的研究開發概況［J］.天然產物研究與開發，1995，7(1):70-76.

［7］ Mar1n F R，Martinez M，Uribesalgo T，et al.Changes in nutraceutical composition of lemon juices according to different industrial extraction systems［J］.Food Chemistry，2002，78(3):319-324.

［8］ 仇農學，高霞.蘋果籽油的超聲波輔助提取及理化性質分析［J］.食品科學，2008，28(11):50-55.

［9］ 吳厚玖，孫志高，王華.試論我國柑橘加工業發展方向［J］.食品與發酵工業，2006，32(4):85-89.

［10］ 李維莉，馬銀海，張亞平，等.菱角殼總黃酮超聲輔助提取工藝研究［J］.食品科學，2009，30(14):140-142.

［11］ 陳國安，周桃英.超聲波輔助提取苦蕎黃酮工藝的優化［J］.湖北農業科學，2012(22):5 144-5 146.

［12］ Dolatowski Z J，Stadnik J，Stasiak D.Applications of ultrasound in food technology［J］.Acta Sci Pol，Technol Aliment，2007，6(3):89-99.

［13］ 郝云彬，葉興乾，徐黎.超聲技術在橘皮中提取橙皮苷的應用［J］.食品與發酵工業，2006，31(11):63-66.

［14］ MA Y，YE X，HAO Y，et al.Ultrasound-assisted extraction of hesperidin from Penggan peel［J］.Ultrasonics Sonochemistry，2008，15(3):227-232.

［15］ 黃運紅，高興強，黎偉偉，等.超聲波提取臍橙皮黃酮類化合物的工藝研究［J］.食品科學，2009，30(16):102-105.

［16］ 王華，任廷遠，安玉紅.超聲波輔助乙醇提取柑橘皮渣發酵液總黃酮工藝研究［J］.食品科學，2009，30(24):206.

［17］ 張玉，曾凡坤，吳劍.響應面法優化柑橘皮渣中類黃酮的超聲波提取工藝［J］.食品科學，2010(8):28-32.

［18］ 劉蓉，周正勇，羅南芳，等.超聲波法提取塔羅科血橙皮黃酮類化合物工藝的優化［J］.湖北農業科學，2013，17:047.

［19］ 李杰，吳厚玖，馬亞琴，等.酶法真空間歇處理脫除臍橙果皮和囊衣的條件優化［J］.食品科學，2014，35(2):18-22.

［20］ YANG Y，ZHANG F.Ultrasound-assisted extraction of rutin and quercetin fromEuonymus alatu sieb［J］.Ultrasonics sonochemistry，2008，15(4):308-313.

［21］ XU Y，PAN S.Effects of various factors of ultrasonic treatment on the extraction yield of all-trans-lycopene from red grapefruit［J］.Ultrasonics Sonochemistry，2013，20(4):1026-1032.

［22］ Herrera M C，Luque de Castro M D.Ultrasound-assisted extraction of phenolic compounds from strawberries prior to liquid chromatographic separation and photodiode array ultraviolet detection［J］.Journal of Chromatography A，2005，1 100(1):1-7.

［23］ Cacace J E，Mazza G.Mass transfer process during extraction of phenolic compounds from milled berries［J］.Journal of Food Engineering，2003，59(4):379-389.

［24］ 孫國金.超聲輔助竹川黃酮提取研究［D］.杭州:浙江大學，2003.

［25］ Knorr D，Zenker M，Heinz V，Lee.D.U.Applications and Potential of ultrasonics in food Processing［J］.Trends in Food Seienee ＆ Technology.2004，15:261-266.

［26］ Lorimer J P，Mason T J Sonochemistry:Theory Applications and Uses of Ultrasound in Chemistry［M］.England:Ellis Horword Limited，1988:252.

［27］ Trabelsi F，Ait-Lyazidi H，Berlan J，et al.Electrochemical determination of the active zones in a high-frequency ultrasonic reactor［J］.Ultrasonics Sonochemistry，1996，3(2):S125-S130.

［28］ 張元梅，周志欽，葉興乾，等.高效液相色譜法同時測定柑橘果實中18種類黃酮的含量［J］.中國農業科學，2012(17):3 558-3 565.