天山一號冰川融水中耐冷酵母菌多樣性及系統發育*

鄭曉吉，孫海龍，關波，姜遠麗，倪永清

(石河子大學食品學院，新疆石河子，832000)

地球上超過80%的環境溫度周期性或永久地低于5℃，如深海(90%的海洋溫度低于5℃)、海冰、南北兩極及高山荒漠、冰川和凍土。其中山岳冰川最大特點是常年存在大量的冰塊，溫度始終在0℃以下，上世紀末以來科學家發現冰川中蘊藏著豐富的嗜冷真核和原核微生物資源，包括古菌、細菌、藍藻、酵母、絲狀真菌、藻類和原生生物等，并對微生物的嗜冷機制，包括不飽和脂肪酸、冷沖擊蛋白、熱激蛋白和低溫酶等進行了深入研究［1］。

酵母菌作為一類重要的微生物資源，在食品、醫藥、發酵工業、飲料生產等行業被廣泛應用。Lachance等人發現，酵母菌是營養代謝極其多樣的一類真核微生物，在自然界差異明顯的微環境中，能夠利用不同的底物，展現出極強的生存能力，甚至進化出比細菌更好的適應低溫環境的能力［2］。因此，充分研究極端低溫環境中嗜冷酵母菌資源，對認識生物的進化機制、物種多樣性以及開發其生物技術利用潛力具有重要的意義。Pietro等人概述了全球嗜冷酵母的分布和嗜冷機制，對南極洲、北極、南美洲、歐洲冰川、亞洲和喜馬拉雅地區的低溫酵母菌有了詳細的報道，并且開發了它們的生物技術潛力，特別是冷活性酶的來源和生物降解的能力。目前國內外已發現記述的低溫酵母菌超過120種(其中子囊菌20種，擔子菌102種和類酵母2種)，大約1/3的菌株屬于隱球菌屬，而且每年不斷有許多新種發現［1］。

我國冰川凍土資源非常豐富，對這些低溫環境中細菌的多樣性已有較多報道［3-4］，但對低溫環境中生存的酵母菌等真核微生物資源的研究非常少，這對全面認識地球上極端環境微生物的物種多樣性，尤其是酵母菌物種多樣性、生態分布特征是一個缺憾。隨著全球氣候變暖，冰川持續退縮，嗜冷微生物的生存環境不斷遭到破壞，開發和認識這些低溫微生物迫在眉睫。

天山烏魯木齊河源一號冰川是我國在冰川水文、氣候變化、生態退縮等基礎研究方面最為詳盡的冰川。本研究從天山一號冰川底部沉積層空水及融水中分離篩選耐低溫酵母菌菌株，通過分子生物學方法揭示菌株的物種多樣性、系統進化關系，了解其生態生理及產胞外酶特征，以期為后續研究開發低溫酵母菌的生物技術利用潛力奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑和儀器

用于PCR擴增的全套試劑及擴增引物均購自TaKaRa公司;相關生理生化試驗所用試劑均購自于天津市巴斯夫化學試劑廠及天津市致遠化學試劑廠。高速冷凍離心機(Fresco21)，Thermo公司;PCR儀(Tprofessional)，德國 Biometra公司;水平電泳儀(PowerPac Universal)，美國 BioRad公司;凝膠成像系統(Gel DOC XR)，BioRad公司;電泳槽SUBCELL GT(20 cm ×25 cm)。

1.1.2 培養基

①分離培養基(RB):瓊脂15 g/L，葡萄糖10 g/L，蛋白胨5 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，氯霉素0.1 g/L，Dichloran溶液1 mL/L(濃度:每10 mL蒸餾水中Dichloran 0.2 g);Rose Bengal溶液0.5 mL/L(濃度:每10 mL蒸餾水中Rose Bengal 0.5 g)，pH調至5.6。②基礎培養基(YEPD):麥芽浸膏30 g/L，蛋白胨0.5 g/L，瓊脂 15 g/L，pH 調至 5.6。③產酶培養基:低溫酵母產酶菌株的分離和培養根據Buzzini和 Martini的方法進行［5］。

1.2 樣品采集

從烏魯木齊河源天山一號冰川站，海拔3 250 m以上區域(年平均地溫為-4.95℃)的高寒環境中采集冰川流動和沉積兩種融水，溫度分別為1℃和1.5℃，將水樣迅速裝入己滅菌的廣口瓶內，置于車載冰箱中保存。運回實驗室后立即過濾并富集融水中微生物，過濾液于4℃保存備用。以上所有過程均在無菌條件下完成。

1.3 菌株的分離和保藏

菌株分離采用酵母菌基礎培養基［6］和分離培養基［7］。菌株分離方法:在超凈工作臺上用孔徑為0.22 μm的濾膜過濾水樣，收集濾膜上的菌體。采用梯度稀釋平板涂布法分離水樣品中的可培養酵母。15℃恒溫培養箱中培養2～3 d，待菌落長出后，根據菌落顏色、大小、形態等表型差異進行初步分離，轉接劃線后，將所得純培養物轉接到YEPD斜面培養基中4℃備用。已純化菌株保存于裝有20%滅菌甘油管的保藏管中，并存于-70℃冰箱保藏。

1.4 低溫酵母菌形態學和生理生化特性鑒定

1.4.1 酵母菌形態特征

根據酵母菌分類學鑒定標準方法對供試菌株進行鑒定［8］。

1.4.2 最適生長溫度的測定

將活化的酵母菌種以0.5 mL的接入量接入裝有5 mL的YEPD(pH 5.6)液體富集培養基中，分別在4、10、15、20及25℃的5個溫度梯度的培養箱中培養24 h后，420 nm測OD值。

1.4.3 最適pH的測定

按10%接種量將酵母菌分別接種于pH 4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5及7.0的7個梯度的50 mL YEPD 液體培養基中，15℃培養24 h后，420 nm測OD值。

1.4.4 耐鹽性

制備初始 NaCl含量為0.02、0.04、0.06、0.08、0.12和0.16 g/mL的基礎培養基，接入活化的酵母菌，10℃培養1周后，420 nm測OD值。

1.5 PCR擴增及測序

1.5.1 總DNA提取

用Makimura等［9］方法提取菌株總DNA。

1.5.2 PCR擴增26S rDNA D1/D2區基因［6］

采用酵母菌通用引物NL1(5'-GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG-3')和NL4(5'-TCC TCC GTC TAT TGA TAT GC-3')對26S rDNA D1/D2區基因片段進行PCR擴增。擴增條件［10］:95℃預變性5 min，94 ℃變性 40 s，55 ℃退火 40 s，72 ℃延伸 30 s，36個循環，72℃延伸10 min。反應在Bio-Rad iCycler Thermal Cycler上進行。1.2%瓊脂糖凝膠電泳確認擴增效果和片段大小。

PCR產物用EZ-10 column PCR Product Purification kit(BIO BASIC INC，Canada)純化后，由上海生工生物科技有限公司采用ABI377 DNA自動測序儀直接測序。

1.6 低溫酵母菌多樣性分析

供試菌株的測序結果用Chromas參照正反序列圖譜人工校對，校正后的26S rDNA D1/D2區序列在GenBank數據庫中進行同源序列搜索(BLAST)［11］，比較供試菌株與已知酵母菌相應序列的同源性。為進一步顯示實驗菌株與已知酵母菌的親緣關系及其分類地位，根據同源序列搜索結果，下載相關酵母菌菌種的26S rDNA D1/D2區序列，與實驗菌株序列一起用 Clustal X1.83軟件進行匹配排列(align)［12］，用MEGA 4.1軟件中的neighbor-joining分析法構建系統發育樹，并進行1 000次Bootstraps檢驗。

1.7 產酶菌株MSP-PCR指紋圖譜分析

采用單引物M13(5'-GAG GGT GGC GGT TCT-3')進行 PCR 擴增［13］，擴增條件［12］:95℃ 預變性 5 min，93 ℃變性45 s，50 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，40個循環，72℃延伸6 min。取10 μL擴增產物在1.5%瓊脂糖凝膠、0.5×TBE電泳緩沖液、80 V/cm條件下電泳檢測4 h。根據PCR擴增產物指紋帶譜的有無，再統計分析將條帶轉化為只含有1和0兩值變量的矩陣，使用NTSYS-pc 2.01(Applied Biostatistics，Inc)軟件采用非加權算術平均連鎖法(UPGMA，unweighted pair group method with arithmetic mean)進行聚類分析。

2 結果與分析

2.1 酵母菌株的細胞形態與最適生長溫度、pH、耐鹽性及菌落形態

實驗從冰川融水水樣中篩選了68株純培養物，顯微鏡鏡檢顯示全為酵母。由圖1可見，在顯微鏡下，分離出的酵母菌具有明顯的細胞核，是典型的真核細胞結構，細胞呈球圓形或卵圓形，大小相差懸殊，細胞直徑在(1～5)μm×(5～30)μm。

依據菌落形態、顏色、大小以及細胞形態，篩選15株作為代表菌株做進一步的研究(表1)。研究結果表明，在15株代表菌株中，4株菌最適生長溫度為20℃左右，在35℃停止生長，屬耐冷菌范疇;有5株菌最適生長溫度為15℃左右，生長溫度范圍在0～20℃，屬于專性嗜冷菌;其他6株菌在耐冷菌與專性嗜冷菌之間。根據最適pH實驗結果可知，本次研究的15株代表菌株的最適pH均為4.6～6.5。在耐鹽性研究中，產酶菌株大多數最大耐鹽度為6%，耐鹽性最高的菌株是BCY-4和BCY-10，在8%時仍可以生長，但生長緩慢，而其他大多數菌株在此濃度下基本停止生長。菌株BCY-1、BCY-3、BCY-5、BCY-9和BCY-10的菌落較小，為1～2 mm;其余的在2～4 mm。菌株BCY-3、BCY-7、BCY-13和 BCY-15的菌落顏色為橘黃色;BCY-3、BCY-7和BCY-9為紅色;BCY-4、BCY-5和BCY-6為黃色，其余均為白色。

圖1 酵母菌在熒光顯微鏡下的細胞形態Fig.1 Cellular morphology of yeast under the fluorescent microscope

表1 低溫酵母菌株的生長特性與形態特性Table 1 Growth characteristics and morphological characteristics of psychrophilic yeast

2.2 基于26S rDNA基因D1/D2區域序列的系統發育分析

圖2 基于26S rDNA區域序列和neighbor-joining分析繪制的系統發育樹Fig.2 Based on the 26S rDNA regional sequence and neighbor-joining analysis rendering phylogenetic tree

根據鏡檢結果篩選的15株(3株來自流動水樣，12株來自沉積水樣)具有代表性的菌株進行了測序鑒定。鑒定結果顯示，15株酵母菌隸屬于擔子菌綱(Basidiomycetes)和子囊菌綱(Ascomycetes)2個系統發育類，共7個屬。子囊菌綱僅分離到BCY-12，屬于畢赤酵母屬(Pichia)，其余14株酵母均屬于擔子菌綱。在擔子菌綱中，隱球酵母屬(Cryptococcus)6株，所占比例最大，達到了40%，其次是紅酵母菌屬(Rhodotorula)2株和擲孢酵母屬(Sporobolomyces)2株，分別占13.3%。

2.3 低溫酵母菌的產酶形態及產酶情況

由表2可知，產酶菌株總數為38株，Cryptococcus屬產酶菌株所占比例最大，達到了48.57%，且Cryptococcus屬的菌株全部可以產淀粉酶和蛋白酶。在本次研究中，分離到的酵母菌中能夠產淀粉酶和蛋白酶的菌株數量最多，且產酶菌落透明圈的半徑達到3～4 mm，除菌株BCY-4、BCY-10外，其他11菌株均產淀粉酶，占總菌株的73.33%;除菌株BCY-6外，其余均產蛋白酶，占總菌株的73.33%;其次產脂肪酶菌株為7 株，分別為 BCY-2、BCY-5、BCY-6、BCY-9、BCY-10、BCY-13和BCY-15，占總菌株的46.67%;產酯酶菌株為4株，分別為 BCY-1、BCY-3、BCY-4和 BCY-9，占總菌株的26.67%;產果膠酶菌株為BCY-1、BCY-9和BCY-15，占總菌株的20%;產幾丁質酶菌株為BCY-11和BCY-12，分別來自不同的屬，占總菌株的20%。

2.4 指紋圖譜與聚類分析

15株代表菌株，經26S rDNA D1/D2區序列鑒定，隸屬于7個屬，為了進一步鑒定產酶酵母的種間差異，采用MSP-PCR指紋圖譜技術對15株代表菌株做了進一步的研究。圖3A為15株產酶菌株的指紋圖譜，15株菌株共出現16種不同的條帶，每個菌株產生的條帶數在1～10之間，圖3B為指紋圖譜聚類分析樹狀圖。經26S rDNA D1/D2區鑒定相似性較高的6株隱球酵母菌(Cryptococcus)條帶差異較大，聚為5個不同的群，在75%的相似水平上，BCY-6與BCY-8為一群，表型特征相近，說明BCY-6與BCY-8相似性較高，另外BCY-2與BCY-14，BCY-5與BCY-8的聚類分析圖顯示親緣關系相近;BCY-11(Cryptococcus festucosus)獨立存在于一個分支，說明BCY-11與其他菌株親緣關系最遠。

表2 天山一號冰川可培養低溫酵母菌產酶情況Table 2 Enzyme production situation of Tianshan mountain glacier Psychrophilic cultivate yeasts

圖3 低溫酵母菌株的MSP-PCR指紋圖譜(A)與聚類分析樹狀圖(B)Fig.3 MSP-PCR fingerprint patterns(3A)and dendrogram obtained by UPGMA cluster analysis of the PCR data sets(3B)

3 討論

本研究從冰川中分別采集到流動水和沉積水兩種融水樣品，共分離得到68株低溫酵母，選取代表性菌株15株進行后續實驗，其中3株來自流動水樣，12株來自沉積水樣，由于沉積水流速緩慢，且離冰川前沿較遠，沉積的過程中積累了大量可供微生物代謝的營養物質，所以沉積水中微生物種類與數量比流動水中要多。待測菌株與GenBank數據庫中菌株的比對發現隸屬于7個屬(1個子囊菌屬和6個擔子菌屬)，隱球酵母屬(Cryptococcus)是一種機會致病性真菌，在本次所篩選的菌株中占到總數的40%，產低溫酶的比例最大，這一結果與其他地區分離出低溫酵母菌的優勢菌種相一致［1-3］;其次是紅酵母菌屬(Rhodotorula)和擲孢酵母屬(Sporobolomyces)，分別占13.3%。26S rDNA 5'末端有一個長約600bp的 D1/D2序列，根據Petercon［20］對核苷酸序列可變區D2的多態性分析，發現這一區域在同種間的該區域核苷酸的差異小于1%，而不同種之間的差異通常遠遠大于這個數據，雖然同一系統發育類群的菌株其26S rDNA序列相似性很高，還應該結合表型特征以及更精確的分子指紋技術來區分和篩選高效產酶菌株。如BCY-3與 BCY-7隸屬于 Rhodotorula屬，雖然其26S rDNA基因序列相似性極高，但表型特征有差異，產酶結果也不相同，尤其是26S rDNA序列同源性很高的Cryptococcus屬，依據MSP-PCR指紋技術明顯可區分為4個亞群，基本與其生理生化特征差異相一致，因此研究的6株隱球酵母菌很可能隸屬于4個種，這可能與不同菌株的不同生存環境有關，多種因素改變了菌株的生理生化和表型特征，但并沒有改變保守的、非蛋白質編碼基因26S rRNA 基因［16］。觀察實驗結果可知，BCY-2、BCY-3、BCY-7、BCY-13和 BCY-15為橘黃色，BCY-9為紅色，BCY-4、BCY-5、BCY-6 和 BCY-8 為黃色，隱球酵母屬(Cryptococcus)以白色為主，Jong Kook Kim的研究指出，使用萃取法從冬孢酵母(Rhodosporidium sp.)［17］中提取β-胡蘿卜素，對提取色素及類胡蘿卜素等營養素將會有進一步的開發研究，未來可能會運用到實際生產中。

本研究對冰川中可培養酵母菌進行了分離篩選，了解了冰川中低溫酵母菌的生長特性、系統發育和物種多樣性，并對其代表菌株能否產胞外酶進行了實驗驗證，可確定相應酵母菌是否具有產胞外酶的能力，在后續實驗中會對低溫酵母菌的產酶活性進行實驗驗證與拓展，以及使用宏基因組學對冰川中低溫酵母菌的總DNA建立克隆文庫，以期更加準確地了解極端環境中酵母菌的系統進化地位。

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