利用二維電泳技術(shù)檢測大麥種子純度*

隋麗麗，榮芷銘，董慧明，董亮，祖國仁，趙長新

1(大連工業(yè)大學(xué)，生物工程學(xué)院，遼寧 大連，116034)2(遼寧省食品檢驗檢測院，遼寧沈陽，110015)

大麥作為啤酒釀造的主要原料，大麥品種的純度是大麥質(zhì)量的一項重要指標(biāo)。由不同大麥品種制得的麥芽差異性也是導(dǎo)致啤酒酒體差異的因素之一［1］。近些年來，隨著國際大麥價格的持續(xù)走高，市場上不同品種大麥的價格相差每噸達數(shù)十美元［2］，這就導(dǎo)致一些商家以次充好或者好壞混合再以好的出售，甚至在大麥的產(chǎn)地就已經(jīng)出現(xiàn)上述情況。我國每年大麥的進口量很大，國內(nèi)大麥由于質(zhì)量等因素一直很難滿足國內(nèi)啤酒生產(chǎn)的需要。因此，若不能對大麥純度進行準(zhǔn)確檢測，將會對我國大麥消費及啤酒企業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。

目前，國內(nèi)外已建立了多種利用生物化學(xué)與分子生物學(xué)對大麥品種純度檢測方法，主要以大麥種子醇溶蛋白的單向電泳法和基于DNA技術(shù)的分子標(biāo)記法為主［3］。利用大麥提取醇溶蛋白進行SDS-PAGE電泳檢測具有簡便快捷、費用低、穩(wěn)定性高的優(yōu)點［4］，但由于單向電泳條帶比較密集，容易對檢測造成一定的困難和誤差。因此，很多企業(yè)逐漸采用DNA分析技術(shù)進行SSR標(biāo)記［5-6］，其結(jié)果雖然很準(zhǔn)確，但對樣品DNA提取技術(shù)及設(shè)備的要求非常嚴(yán)格，檢測的成本較高，對于一般企業(yè)的使用存在一定困難。隨著分析技術(shù)的發(fā)展，利用雙向電泳技術(shù)檢測大麥種子純度已成為可能。

目前，二維電泳技術(shù)已成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究的核心和首選技術(shù)［7-8］，利用二維電泳技術(shù)能夠比較、分析生物樣品在不同條件下蛋白質(zhì)組的動態(tài)變化，從而發(fā)現(xiàn)和鑒定出特異功能的蛋白質(zhì)及基因。二維電泳技術(shù)利用的是蛋白質(zhì)等電點和分子質(zhì)量2個特性，在水平(第一向)和豎直(第二向)方向分別進行蛋白質(zhì)的等點聚焦和聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，進而得到蛋白質(zhì)的二維分離圖譜。隨著植物功能基因組學(xué)研究的深入，該技術(shù)已在擬南芥［9-10］，水稻［11-12］等模式植物中得到廣泛應(yīng)用;對于一些非模式生物，如大豆［13］、煙草［14］、番茄［15］等，也展開了相關(guān)研究，并且雙向電泳圖譜可得到更多蛋白質(zhì)點，檢測準(zhǔn)確快速，且較基因法更經(jīng)濟，不失為一種大麥純度檢測的可靠方法。

本論文利用雙向電泳技術(shù)結(jié)合PDQuest軟件，對人工混種的不同純度大麥種子進行蛋白質(zhì)圖譜分析，找出不同大麥品種間的差異蛋白質(zhì)點，并對差異蛋白質(zhì)點進行圖譜的3D峰高度比較，建立了純度與差異蛋白質(zhì)點3D圖峰高度間的關(guān)系，從而實現(xiàn)了對大麥種子的純度分析檢測與方法建立。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

大麥純品種:甘啤4號、單2號，由百威英博啤酒集團哈爾濱有限公司提供。

1.2 實驗儀器

多功能電泳儀，北京六一儀器廠;Binta 2020D凝膠成像系統(tǒng)，BINTA;PDQuest8.0分析軟件，Biorad公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 蛋白質(zhì)提取

分別取甘啤4號、單2號大麥各1 g，去皮后加液氮研磨，采用緩沖液苯酚法提取大麥中的水溶蛋白質(zhì)，Bradford法測定蛋白質(zhì)濃度后分裝，置于-80℃冰箱中備用［16］。

1.3.2 雙向電泳操作

(1)膠條制作。在翟明昌［17］的方法基礎(chǔ)上略加改進:取 0.6g 尿素，540 μL 雙蒸水，200 μL 30%丙烯酰胺溶液，pH值4～6載體兩性電解質(zhì)24 μL，pH值3～10載體兩性電解質(zhì)溶液4.8 μL，輕緩混勻后依次加入5 μL 10%過硫酸銨和4 μL TEMED。混勻后快速吸取100 μL上述混合液，從玻璃管(直徑1mm，長10 cm)的一端緩慢均勻灌入，注膠量保證每根膠長度為7 cm，室溫聚合1 h。

等電聚焦及電泳:陰極電泳緩沖液:20 mmoL/L NaOH 150 mL;陽極電泳緩沖液:10 mmoL/L H3PO4200 mL。

(2)電泳條件。接通電源，室溫下200 V恒壓電泳30 min，500 V恒壓電泳30 min，1 350 V恒壓電泳4 h。

等電聚焦結(jié)束后將膠條從玻璃管中緩慢均勻擠出，在含 0.05 moL/L Tris-HCl(pH 8.8)、0.3 g/mL甘油、23 mg/mL SDS、6 mmoL/L尿素的平衡緩沖液中平衡30 min，轉(zhuǎn)移至12%分離凝膠，20 mA恒流電泳。電泳結(jié)束后，將得到的凝膠進行“Blue Silver”考馬斯亮藍染色，雙蒸水脫色［18］。

(3)凝膠圖像分析。通過Binta 2020D型凝膠成像系統(tǒng)進行拍照，PDQuest8.0軟件進行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同品種及不同純度大麥雙向電泳分析

對甘啤4號、單2號大麥進行雙向電泳實驗，得到電泳圖譜如圖1所示。

圖1 甘啤4號和單2號大麥雙向電泳圖譜Fig.1 Proteome analysis of Ganpi 4 and Dan 2 barley cultivars by two-dimensional electrophoresis

經(jīng)過PDQuest 8.0軟件分析，純種的單2號大麥對比純種的甘啤4號大麥明顯缺失2種蛋白質(zhì)，即圖1中方框內(nèi)所示蛋白質(zhì)點。由此可見，不同品種大麥間的蛋白質(zhì)種類差異性是比較顯著的。根據(jù)這一差異性，將2種大麥經(jīng)過人工混合得到純度為100%、80%、65%、40%、18%、0%的甘啤4號大麥樣品進行雙向電泳分析，結(jié)果如圖2所示。將2種大麥間的差異蛋白質(zhì)點標(biāo)注為1號點和2號點(圖2)。從圖2(A～E)中各圖可清楚的看出不同品種純度的大麥在1、2兩點處的大小和顏色深淺程度的差異，這說明蛋白點1和2是甘啤4號和單2大麥主要的差異點，并且其主要存在于甘啤4號大麥中，它們的有無及含量可以代表不同純度的甘啤4號大麥。

圖2 不同純度大麥差異蛋白點1、2的變化Fig.2 Comparison of plot 1and 2 in different purity barley

2.2 差異蛋白質(zhì)點圖譜3D高度與甘啤4號大麥純度的關(guān)系建立

根據(jù)不同純度間大麥的差異蛋白質(zhì)點大小及顏色深淺變化，應(yīng)用PDQuest 8.0軟件對各圖譜的差異蛋白質(zhì)點1、2生成3D圖(如圖3、圖4所示)進一步分析其差異性。

圖3 不同大麥純度下差異蛋白質(zhì)點1的3D圖Fig.3 3D visual comparison of plot 1 from different purity Ganpi 4 barley using PDQuest 8.0 software

圖4 不同大麥純度下差異蛋白質(zhì)點2的3D圖Fig.4 3D visual comparison of plot 2 from different purity Ganpi 4 barley using PDQuest 8.0 software

不同純度甘啤4號大麥差異蛋白質(zhì)點3D圖高度數(shù)值如表1所示。從圖3和圖4中可以看出，不同大麥純度下的差異蛋白質(zhì)點在雙向電泳圖譜的3D圖中峰高有明顯的差異，并且大麥純度與峰高呈現(xiàn)出一定的線性相關(guān)性，為了進一步驗證這一點，對其進行線性回歸，其結(jié)果如5和圖6所示。

圖5 差異蛋白質(zhì)點1的3D圖高度值與大麥純度線性回歸曲線Fig.5 Linear regression curve of 3D values and purity of plot 1

圖6 差異蛋白質(zhì)點2的3D圖高度值與大麥純度線性回歸曲線Fig.6 Linear regression curve of 3D values and purity of plot 2

由圖5和圖6可知，差異點1的線性回歸方程為y=30.825x2+7.994 9x-0.863 1(R2=0.993 6);差異點2的線性回歸方程為y=13.83x2+19.717x-0.848 7(R2=0.993 5)。2條曲線顯示出大麥純度與峰高之間呈現(xiàn)高度的線性相關(guān)性，并且可以應(yīng)用這兩個方程檢查混合品種中甘啤4號大麥的純度。

表1 不同純度甘啤4號大麥差異蛋白質(zhì)點3D圖高度數(shù)值Table 1 3D values of plot 1 and 2 in different purity Ganpi 4 barley

2.3 應(yīng)用已知純度大麥檢驗回歸方程的準(zhǔn)確性

為了驗證2.2中所得到方程的準(zhǔn)確性，另取混入單2號大麥的甘啤4號大麥，得到純度為50%和80%的甘啤4號大麥樣品，并進行雙向電泳，得到其差異蛋白質(zhì)點的雙向電泳圖譜3D圖如圖7所示。

圖7 差異蛋白質(zhì)點3D圖Fig.7 3D visual comparison of plot 2 from 50%and 80%purity Ganpi 4 barley using PDQuest 8.0 software

純度為50%的大麥樣品中，差異蛋白質(zhì)點1的高度為1.3，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線得純度為49%，誤差為1%;差異蛋白質(zhì)點2的高度為1.1，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線得純度為45.2%，誤差為4.8%。純度為80%的大麥樣品中，差異蛋白質(zhì)點1的高度為1.8，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線得純度為79.4%，誤差為0.6%;差異蛋白質(zhì)點2的高度為1.5，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線得純度為80.5%，誤差為0.5%。由此可見，該方程具有較高的準(zhǔn)確性。因此，可以利用差異蛋白質(zhì)點的3D高度數(shù)值來檢測大麥樣品的純度。

3 結(jié)論

本實驗通過對甘啤4號和單2號2種大麥人工混和后所得到的不同純度大麥種子進行雙向電泳并進行圖譜分析，找出了2種大麥品種間的主要差異蛋白質(zhì)點，得到了各差異點的3D高度數(shù)值，應(yīng)用該數(shù)值與大麥純度進行線性擬合，得到了不用差異蛋白質(zhì)點相關(guān)的線性回歸方程。同時，運用該方程對純度為50%和80%的甘啤4號大麥種子的純度進行檢測以考察其準(zhǔn)確性，實驗取得了良好的效果，由此說明利用雙向電泳技術(shù)可以檢驗大麥種子的純度。

［1］ 鄭飛云，張俊炎，陸健，等.釀造大麥品種及純度的鑒定［J］.啤酒科技，2002(6):4-6.

［2］ 林艷，梅承芳，董建軍，等.利用蛋白質(zhì)“指紋”技術(shù)鑒定加拿大啤酒大麥的品種和純度［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2005，31(6):97-100.

［3］ 李淑娟.種子純度鑒定方法概述［J］.青海大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2003，21(1):16-19.

［4］ 李守明，梁維，魏凌基，等.利用兩種電泳技術(shù)分析大麥品種的醇溶蛋白差異及親緣關(guān)系［J］.石河子大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2011，29(1):15-19.

［5］ 陳志偉，李梁，陸瑞菊，等.一種利用 SSR分子標(biāo)記對大麥雜交種快速鑒定的方法［J］.浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報，2010，22(6):736-740.

［6］ Lababidi S，Mejlhede N，Rasmussen S K，et al.Identification of barley mutants in the cultivar‘Lux’at the Dhn loci through TILLING［J］.Plant breeding，2009，128(4):332-336.

［7］ Choe L H，Lee K H.A comparison of three commercially available isoelectric focusing units for proteome analysis:The multiphor，the IPGphor and the protean IEF cell［J］.Electrophoresis，2000，21(5):993-1 000.

［8］ Cutler P，Bell D J，Birrell H C，et al.An integrated proteomic approach to studying glomerular nephrotoxicity［J］.Electrophoresis，1999，20:3 647-3 658.

［9］ Gallardo K，Job C，Groot S P C，et al.Proteomics of Arabidopsis seed germination:A comparative study of wild-type and gibberellin-deficient seeds［J］.Plant Physiol，2002，129:823-837.

［10］ Rutschow H，Ytterberg A J，F(xiàn)riso G，et al.Quantitative proteomics of a chloroplast SRP54 sorting mutant and its genetic interactions with CLPC1 in Arabidopsis［J］.Plant Physiol，2008，148:156-175.

［11］ Parker T，F(xiàn)lowers T J，Moore A L，et al.An accurate and reproducible method for proteome profiling of the effects of salt stress in the rice leaf lamina.J Exp Bot，2006，57:1 109-1 118.

［12］ Kim S T，Kim S G，Kang Y H，et al.Proteomics analysis of rice lesion mimic mutant(sp/1)reveals tightly localized probenazole-induced protein(PBZ1)in cells undergoing programmed cell death［J］.J Proteome Res，2008，7:1 750-1 760.

［13］ Natarajan S，XU C，Caperna T J，et al.Comparison of protein solubilization methods suitable for proteomic analysis of soybean seed proteins［J］.Anal Biochem，2005，342:214-220.

［14］ Amme S，Rutten T，Melzer M，et al.A proteome approach defines protective functions of tobacco leaf trichomes［J］.Proteomics，2005，5:2 508-2 518.

［15］ Chen S B，Gollop N，Heuer B.Proteomic analysis of saltstressed tomato(Solanum lycopersicum)seedlings:Effect of genotype and exogenous application of glycinebetaine［J］.J Exp Bot，2009，60:2005-2019.

［16］ Bradford M M.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding［J］.Analytical biochemistry，1976，72(1):248-254.

［17］ 翟明昌，樸永哲，王祥余，等.混菌發(fā)酵中不同分子量代謝產(chǎn)物對非釀酒酵母胞內(nèi)蛋白及酒體有機酸的影響［J］.微生物學(xué)通報，2011，38(9):1 443-1 448.

［18］ Candiano G，Bruschi M，Musante L，et al.Blue silver:a very sensitive colloidal Coomassie G‐250 staining for proteome analysis［J］.Electrophoresis，2004，25(9):1 327-1 333.