DNA甲基化在植物中的研究

包長(zhǎng)春，趙 永，陳永勝，4* ，羅 蕊，黃鳳蘭，4，李國(guó)瑞，4，邢 超，李 躍，孫華軍

(1.內(nèi)蒙民族大學(xué)農(nóng)學(xué)院，內(nèi)蒙古通遼 028024;2.內(nèi)蒙古通遼市土壤肥料工作站，內(nèi)蒙古通遼 028024;3.內(nèi)蒙古民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古通遼 028024;4.內(nèi)蒙古自治區(qū)高校蓖麻產(chǎn)業(yè)研究中心，內(nèi)蒙古通遼 028024)

時(shí)間和空間復(fù)雜且準(zhǔn)確的配合是所有生物遺傳表達(dá)、發(fā)育的基礎(chǔ)。時(shí)間和空間編碼基因表達(dá)的方向主要受基因控制，通過(guò)一些特殊的序列包括順式作用元件和反式作用因子調(diào)控實(shí)現(xiàn)。然而越來(lái)越多的證據(jù)表明生物發(fā)育過(guò)程中還涉及到表觀遺傳規(guī)律的調(diào)控。有絲分裂和減數(shù)分裂是可遺傳的且與植物的生長(zhǎng)發(fā)育存在密切聯(lián)系，它能夠可逆地改變基因的表達(dá)但不會(huì)改變DNA的序列。5-甲基胞嘧啶是一個(gè)顯著的表觀遺傳修飾，它可以建立和維護(hù)多個(gè)相互作用的細(xì)胞機(jī)制。DNA甲基化在高等真核生物中的主要作用是作為基因防御系統(tǒng)去保護(hù)基因組內(nèi)源性DNA和病毒入侵。此外胞嘧啶甲基化能保護(hù)基因組的完整性，同時(shí)在植物基因組的表達(dá)和抗環(huán)境壓力方面有一定的作用。研究表明胞嘧啶甲基化在調(diào)節(jié)特定組織的基因表達(dá)扮演著重要的角色。如在植物發(fā)育過(guò)程春化處理和染色體印記，都發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄水平上存在復(fù)雜的表觀遺傳規(guī)律。

1 胞嘧啶甲基化在植物基因組的分布

脊椎動(dòng)物核中胞嘧啶甲基化的水平為3% ～8%;植物中是6%～30%。在一些生物包括動(dòng)物、植物、真菌中還發(fā)現(xiàn)，對(duì)稱的二核苷酸GC胞嘧啶甲基化參與生物進(jìn)化過(guò)程中保守的DNA修飾。動(dòng)物和植物的甲基化水平存在顯著不同，植物的甲基化主要發(fā)生在GC上，但動(dòng)物的甲基化總是發(fā)生在CHG(H包括A C T)和對(duì)非稱的CHH等位點(diǎn)。模式生物擬南芥中，大部分甲基化的基因組成串聯(lián)或者反向串聯(lián)，轉(zhuǎn)座子分散重復(fù)，在甲基化基因組的內(nèi)部或者著絲粒區(qū)域含量豐富，因此植物甲基化呈鉗合性質(zhì)。與動(dòng)物的形成對(duì)比，動(dòng)物的呈現(xiàn)連續(xù)的模式。所有表達(dá)的基因約5%的甲基化在激活子和33%的甲基化在轉(zhuǎn)錄區(qū)。胞嘧啶甲基化遠(yuǎn)離基因兩端，這樣被甲基化區(qū)域的既不在3'端也不在5'端。研究還表明，擬南芥總的基因組CG、CHG和CHH，甲基化的水平分別是 24% 、6.7% 和 1.7%［1］。

2 植物中胞嘧啶甲基化的建立和維護(hù)

DNA甲基化在高等植物中主要通過(guò)2個(gè)不同的互補(bǔ)的酶“從頭合成”和“維持”DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶結(jié)合DNA脫甲基酶、組蛋白修飾酶以及染色體重組和RNA干擾技術(shù)來(lái)調(diào)控?！皬念^合成”甲基化是一個(gè)過(guò)程，以前未甲基化胞嘧啶殘基被甲基化，導(dǎo)致形成新的甲基化模式。植物DNA的甲基化轉(zhuǎn)移酶根據(jù)線性區(qū)域分為四大類 (MET1，CMT，DRM和Dnmt2)。在擬南芥中所有序列甲基化的建立全部依賴“從頭合成”甲基化轉(zhuǎn)移酶，它們的功能是通過(guò)RNA指導(dǎo)DNA甲基化調(diào)控模式的路徑［2］。在擬南芥突變體缺少M(fèi)ET1轉(zhuǎn)錄激活的轉(zhuǎn)座子和假基因駐留在異染色質(zhì)區(qū)域，近60%的甲基化區(qū)域成為去甲基化。這些數(shù)據(jù)都為MET1介導(dǎo)的胞嘧啶甲基化的結(jié)論奠定基礎(chǔ)，主要負(fù)責(zé)植物基因組中的異染色質(zhì)區(qū)域的沉默。CGH甲基化主要是通過(guò)特定染色體甲基化酶、組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶，和在某些特定位點(diǎn)是通過(guò)CMT3和DRM2控制的。CMT3的功能很可能在其他植物中非常保守。如與玉米CMT同源的ZMET2和ZMET5在維持CHG甲基化過(guò)程中起著重要的作用。

3 植物中胞嘧啶甲基化

直觀上看，胞嘧啶甲基化方式的消除可以通過(guò)被動(dòng)或主動(dòng)地去甲基化來(lái)實(shí)現(xiàn)。在DNA復(fù)制時(shí)期，當(dāng)在主動(dòng)的去甲基化過(guò)程中被DNA糖基化酶(DME和ROS1)標(biāo)記的甲基標(biāo)記被去除，被動(dòng)去甲基化的胞嘧啶被未甲基化胞嘧啶所代替［3］。DME在雌性配子中，有獨(dú)特的表達(dá)方式。DME(二甲醚)在親本染色體印記的調(diào)控中只有雌性的DME是種子發(fā)育過(guò)程中必不可少的。二甲醚的作用是通過(guò)去甲基化的啟動(dòng)子激活MEA基因的母體(雌性)等位基因來(lái)實(shí)現(xiàn)的。這將導(dǎo)致在2個(gè)活性母體復(fù)制和一個(gè)被印記的父體的MEA基因復(fù)制，從而防止胚乳過(guò)度增殖。最近研究表明，在雌性配子通過(guò)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤途徑進(jìn)入合子的過(guò)程，MET1介導(dǎo)的DNA去甲基化得以實(shí)現(xiàn)。在配子時(shí)期，MET1的表達(dá)可以視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤RBR1和及其相互作用蛋白所抑制。在植物組織中，這種抑制作用引起了雌性的等位基因去甲基化［4］。

4 甲基化與基因表達(dá)的關(guān)系

在植物發(fā)育過(guò)程中調(diào)控轉(zhuǎn)錄的精確分子機(jī)制尚不清晰。研究表明，胞嘧啶甲基化基因表達(dá)的調(diào)節(jié)可以通過(guò)在基因組中基因本身的甲基化和/或其他位置的甲基化，可以調(diào)節(jié)目標(biāo)基因本身離它的距離。研究甲基化周期和甲基化在大麥胚乳發(fā)育過(guò)程中的作用，結(jié)果顯示高的甲基化可以抑制編碼蛋白的基因。分析擬南芥的甲基化作用發(fā)現(xiàn)其基因甲基化作用普遍存在。約1/3的擬南芥基因被甲基化［5］。實(shí)際上，發(fā)現(xiàn)胞嘧啶甲基化是基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄區(qū)域的一個(gè)重要部分，通常被甲基化的基因與未被甲基化的基因相比轉(zhuǎn)錄水平低?；蜃陨淼募谆饔貌荒茏柚够虮磉_(dá)，但能影響基因的表達(dá)水平。在植物中，甲基化的區(qū)域通常阻礙轉(zhuǎn)錄，但甲基化在編碼區(qū)域通常不影響基因表達(dá)，或者影響很少［6］。甲基化的胞嘧啶可以與甲基結(jié)合結(jié)構(gòu)域的蛋白相聯(lián)系，可以作用于不同種類的染色質(zhì)修飾來(lái)形成蛋白質(zhì)。

5 植物生長(zhǎng)過(guò)程中胞嘧啶甲基化的重要性

植物中盡管胞嘧啶甲基化作為基因組的防御系統(tǒng)來(lái)維持基因組的完整，對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育的影響仍不清楚［7］。胞嘧啶甲基化作用于反義的MET1擬南芥植物表現(xiàn)出大量突出的表型，包括減少頂端優(yōu)勢(shì)、改變開花時(shí)間、豐富花的異常和卷曲的葉子。相似的，西紅柿反義MET1植物也表現(xiàn)出相似的表型，表明胞嘧啶甲基化有多效的影響，影響很多涉及在植物發(fā)育中的基因。在植物發(fā)育過(guò)程中提高基因組甲基化，能夠達(dá)到抗逆境的效果，因此推斷甲基化可能與植物抗逆境存在一定的聯(lián)系。DNA甲基化與植物的生長(zhǎng)發(fā)育存在一定的聯(lián)系。DNA甲基化可以影響植物開花，花形成的基因表達(dá)。植物在進(jìn)行有絲和減數(shù)分裂過(guò)程中，甲基化能夠改變DNA的構(gòu)象使其無(wú)法正常與相應(yīng)的蛋白結(jié)合，從而使非編碼區(qū)無(wú)表達(dá)活性。非甲基化的啟動(dòng)子可以使編碼區(qū)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)。去甲基化可以激活沉默的啟動(dòng)子，出現(xiàn)異常表達(dá)。對(duì)去甲基化的研究發(fā)現(xiàn)，在植物發(fā)育過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)組織特異性，為了維持這種特異性，與特異性相關(guān)的基因表達(dá)，與之不相關(guān)的基因不表達(dá)，以此認(rèn)為去甲基化可能與基因活化有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)低溫處理可以降低甲基化水平，開花基因表達(dá)。這種現(xiàn)象有可能是春化的作用機(jī)理。Baurens等［8］對(duì)馬占相思的全基因進(jìn)行甲基化水平檢測(cè)，結(jié)果表明幼嫩葉片的微芽甲基化程度為22.4%，成熟葉片微芽的甲基化程度為20.7%［9］。對(duì)植物的甲基化研究發(fā)現(xiàn)成年植株的甲基化水平，比幼年甲基化水平高。這與Baurens等［8］的結(jié)果相反，即DNA甲基化與植株的衰老存在一定聯(lián)系但并非一定成正相關(guān)。

6 植物發(fā)育過(guò)程中胞嘧啶甲基化的動(dòng)態(tài)

在哺乳動(dòng)物個(gè)體發(fā)育過(guò)程中，具有表觀遺傳標(biāo)記的消失和重建，表現(xiàn)出細(xì)胞特定類型的胞嘧啶甲基化模式［10］。在植物中，沒(méi)有明確的證據(jù)證明通過(guò)發(fā)育使表觀遺傳狀態(tài)復(fù)位，除甲基化的胞嘧啶在胚乳中顯著減少，然而，胚乳始終末分化［11］。相反，在對(duì)幾種植物的甲基化研究表明，穩(wěn)定的胞嘧啶甲基化水平和模式在多代中穩(wěn)定遺傳。對(duì)植物的基因組印跡研究表明，主要通過(guò)DNA糖基化酶活性去除甲基化的胞嘧啶，而不是通過(guò)基因組主動(dòng)去甲基化的胞嘧啶。在整個(gè)植物生長(zhǎng)發(fā)育中，胞嘧啶甲基化和基因沉默存在更密切的聯(lián)系，DNA甲基化發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平，分為轉(zhuǎn)錄前沉默和轉(zhuǎn)錄后沉默。研究表明無(wú)論甲基化發(fā)生在轉(zhuǎn)錄前還是轉(zhuǎn)錄后引起的基因沉默都與啟動(dòng)子的甲基化程度有關(guān)，一般啟動(dòng)子區(qū)域的超甲基化會(huì)引起基因沉默［12］。并不是所有的底甲基化序列都可以被再甲基化，而事實(shí)上，甲基化基因產(chǎn)生的siRNA，取決于RdDM通路，因此siRNA能夠選擇性地促進(jìn)甲基化作用的不足進(jìn)而來(lái)加強(qiáng)沉默。具有組織特異性差異的甲基化區(qū)域(TDMS)已經(jīng)確定其參與哺乳動(dòng)物發(fā)育和組織/器官的分化。據(jù)估計(jì)，5%或以上CpG在哺乳動(dòng)物中是TDM，與CpG都是未甲基化的這一說(shuō)法相違背，TDM在老鼠和人類中較保守，這表示甲基化在調(diào)節(jié)組織細(xì)胞特異的基因表達(dá)之間的區(qū)別中有一定作用。在不同組織中的研究表明，組織特異的DNA甲基化與組織特異的轉(zhuǎn)錄有很大關(guān)系。在植物中相似的系統(tǒng)的研究尚了解，但一些研究可以在不同植物組織中比較整體體現(xiàn)的甲基化水平和差異。早期的研究，通過(guò)HPLC在不成熟的西紅柿組織(莖、葉、根)中來(lái)判斷甲基化的水平，結(jié)果表明，成熟的葉比莖和根的甲基化水平低。在植物中甲基化水平隨植物的發(fā)育而改變，在衰老的組織中可以檢測(cè)到較高的甲基化水平，據(jù)推測(cè)這種改變的趨勢(shì)在得到的結(jié)論是在衰老期的胞嘧啶甲基化是為防止DNA的減少。另外，通過(guò)用MSAP(甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性)分析擬南芥中基因組區(qū)域，在幾個(gè)器官中，包括子葉、葉、花中特異的甲基化被被檢測(cè)到。于此同時(shí)在玉米的秧苗和成熟的植株中存在特異的甲基化。在植物發(fā)育過(guò)程中與胞嘧啶甲基化的動(dòng)態(tài)性相一致，在不同組織器官發(fā)育時(shí)期，甲基轉(zhuǎn)移酶編碼基因的表達(dá)也具有動(dòng)態(tài)性。如Dai等研究了5種基因編碼的小麥 DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，MTases(TaMET1，TaMET2a，TaMET2b，TaCMT和TaMET3)，發(fā)現(xiàn)雖然他們都在發(fā)育中的種子，發(fā)芽的種子和各種營(yíng)養(yǎng)組織中表達(dá)，但在轉(zhuǎn)錄程度變化顯著。然而，這并不意味著在植物發(fā)育時(shí)期DNA轉(zhuǎn)移酶基因特異的時(shí)間空間表達(dá)與DNA甲基化的改變相關(guān)聯(lián)［13］。最近研究表明，關(guān)于在發(fā)育過(guò)程中水稻基因組完全的胞嘧啶甲基化位置和不同的組織胞嘧啶甲基化水平與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性無(wú)關(guān)。因此認(rèn)為不同的DNA轉(zhuǎn)移酶活性與組織/器官和發(fā)育階段甲基化水平?jīng)]有直接的相關(guān)性。

7 展望

目前對(duì)于木本植物甲基化的研究比草本相對(duì)少。雖然擬南芥的全基因組甲基化圖譜已經(jīng)公布。隨著甲基化深入的研究仍有許多問(wèn)題，對(duì)甲基化作用維持的機(jī)制尚不清晰，甲基化引起的一些生物學(xué)現(xiàn)象尚不明確。因此應(yīng)該對(duì)生物信息學(xué)進(jìn)行深入研究，期望驗(yàn)證甲基化的功能?？傊畬?duì)甲基化的研究將有助于揭示其在動(dòng)植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮的作用。

［1］王瑞嫻，徐建紅.基因組DNA甲基化及組蛋白甲基化［J］.遺傳，2014(3):191－199.

［2］陳小強(qiáng)，王春國(guó)，李秀蘭，等.植物DNA甲基化及其表觀遺傳作用［J］.細(xì)胞生物學(xué)雜志，2007(4):519－524.

［3］汪關(guān)雨.DNA甲基化在腫瘤發(fā)生中的作用［D］.太原:山西醫(yī)科大學(xué)，2013.

［4］劉熔.特定基因甲基化研究方法建立及LEAFY基因甲基化與早實(shí)枳階段發(fā)育關(guān)系研究［D］.武漢:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

［5］歐秀芳.重金屬脅迫誘導(dǎo)水稻發(fā)生可遺傳的表觀遺傳變異及其可能作用于水稻提高抗重金屬能力的機(jī)制的研究［D］.長(zhǎng)春:東北師范大學(xué)，2009.

［6］屠發(fā)志，彭世清.植物表觀遺傳與DNA甲基化［J］.生物技術(shù)通訊，2007，1:155 －158.

［7］歐秀芳.重金屬脅迫誘導(dǎo)水稻發(fā)生可遺傳的表觀遺傳變異及其可能作用于水稻提高抗重金屬能力的機(jī)制的研究［D］.長(zhǎng)春:東北師范大學(xué)，2009.

［8］BAURENS F C，NICOLLEAU J，LEGAVRE T，et al.Genmic DNAmethylation of juvenile and mature Acacia mangium micropropagated in vitro with reference to leaf morphology as a phase change marker［J］.Tree Physiology，2004，24(4):401 －407.

［9］張今今，褚會(huì)娟，張逸，等.植物DNA甲基化及在禾本科作物中的研究進(jìn)展［J］.陜西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，4:131 －134.

［10］趙艷麗.水稻中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的原核表達(dá)及功能初步鑒定［D］.長(zhǎng)春:東北師范大學(xué)，2010.

［11］趙欣欣.玉米親本自交系及其雜交種的DNA甲基化水平和模式的遺傳和變異研究［D］.長(zhǎng)春:東北師范大學(xué)，2006.

［12］吳剛.cry1Ab基因在轉(zhuǎn)基因水稻中的遺傳、表達(dá)與沉默［D］.杭州:浙江大學(xué)，2000:63－66.

［13］叢建民，沈海龍，李玉花，等.植物體與植物體細(xì)胞無(wú)性系發(fā)育中的DNA甲基化及其表達(dá)調(diào)控研究進(jìn)展［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011(17):10170 －10174，10196.