組織培養在高粱中的應用研究進展

劉 勇， 王良群， 楊 偉， 郝艷芳， 張 微， 白鴻雁， 張曉娟， 武 擘

(山西省農業科學院高粱研究所,山西晉中 030600)

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組織培養在高粱中的應用研究進展

劉 勇， 王良群， 楊 偉， 郝艷芳， 張 微， 白鴻雁， 張曉娟， 武 擘

(山西省農業科學院高粱研究所,山西晉中 030600)

主要從胚培養、幼葉培養、莖尖培養、幼穗培養、花藥培養、種子培養、幼苗培養、原生質體培養、胚乳培養等方面介紹了高粱組織培養方面的研究進展,最后對高粱組織培養的發展進行了展望。

組織培養；高粱；應用

高粱(Sorghumbicolor(L.)Moench)屬于禾本科(Graminea)高粱族(Andropogoneae)高粱屬(Sorghum)，是全球重要的旱糧作物之一，在非洲、亞洲、大洋洲和美洲的105個國家和地區均有種植，每年大約種植4.2×107hm2，其主產國有美國、尼日利亞、印度、墨西哥、蘇丹、中國、澳大利亞和阿根廷[1]。我國是高粱種植大國，年生產能力在500萬t左右，主要集中在遼寧、吉林、黑龍江、山西和內蒙古等省。其中，遼寧省23.3萬hm2，吉林、黑龍江和山西各13.3萬hm2，內蒙古10.0萬hm2。

高粱在糧食、飼料、糖料和能源以及秸稈利用等方面，有多種值得開發的加工領域[2]。在全球糧食、能源日益短缺的情況下，發展高粱生產，必將有助于緩解這些危機[3]。但高粱育種研究面臨品種遺傳變異性小、遺傳力低、品種改良耗時長等問題。組織培養是指在無菌條件下利用人工培養基對外植體進行培養，是進行遺傳轉化和植物改良研究的基本環節。對高粱組織進行培養及再生，其目的在于讓外植體能夠高頻率地誘導出愈傷組織，建立高效的體細胞再生體系，為高粱遺傳轉化和細胞工程研究創造有利條件[4]。韓福光等[5]報道，最早進行高粱組織培養研究的是Strogonol，1965年，他利用高粱根和分孽節在MS培養基上添加1 mg/L 2,4-D、1 mg/L的KT、5 mg/L泛酸鈣和1 mg/L抗壞血酸誘導出愈傷組織，未能獲得再生植株。之后Maseltler等[6]以芽原基為外植體，在附加1～5 mg/L 2,4-D的MS培養基上誘導出愈傷組織，并獲得了再生植株。此后，高粱組織培養工作不斷進行。筆者根據自己的工作實踐，分別從高粱組織培養胚培養、幼葉培養、莖尖培養、幼穗培養、花藥培養、種子培養、幼苗培養、原生質體培養、胚乳培養等方面對組織培養在高粱中的應用進行綜述，以期為我國高粱育種奠定理論基礎。

1 胚培養

1.1 未成熟胚的培養高粱外植體的培養是組織培養中重要的一步，目前多以未成熟胚為主要材料。國外學者如Gamborg等[7]、Dunsant等[8-9]、Brettel等[10]、Ma等[11]、Lusardi等[12]、Rao等[13]以各類型高粱的未成熟胚為研究對象，通過組織培養誘導出愈傷組織，經過分化成功獲得再生植株。其中Gamborg等[7]、Dunsant等[8-9]、Brettel等[10]各選用不同的雜交種，在現有培養基的基礎上添加內源激素誘導出愈傷組織。Rao等[13]研究在MS培養基中添加2,4-D和不同濃度的天門冬酞氨(L-Asn)和脯氨酸(L-Pro)對高粱愈傷組織誘導的影響，發現高濃度的L-Asn和L-Por較低濃度的L-Asn和L-Por促進愈傷組織的誘導和分化的效果強。Ekoinn等[14]以未成熟胚為研究對象，研究在現有培養基的基礎上添加其他物質對高粱再生植株誘導的影響，結果發現在MS培養基中添加1～5 mg/L 2,4-D，或添加1 mg/L IAA和0.1 mg/L KT混合物，或添加0.1 mg/L KT，或1 mg/L NAA和0.5 mg/L的6-BA混合物，或N6培養基中添加高濃度的天門冬氨酸和脯氨酸均獲得胚性愈傷組織。Ma等[11]、Lusardi等[12]深入研究了不同基因型高粱在形成愈傷組織上的差異及機理。

國內學者也做了大量工作，如馬鴻圖[15]選取20個遺傳來源不同的高粱品種，進行幼胚培養，結果得到5個未成熟胚的小盾片愈傷組織，又經過分化獲得了大量再生植株。郭建華[16]以未成熟胚為對象進行愈傷組織誘導的最適處理時間及生理機理研究，結果表明，高粱未成熟胚的最適胚齡為授粉后的12～13 d，長約1.0 mm；如要提高成功率，處理時間及胚的大小十分關鍵，進一步研究表明再生植株后代中蛋白質含量高于對照親本，單寧含量顯著低于對照親本。建議選取親本時應測定蛋白質含量及單寧含量，選取蛋白質含量高、單寧含量低的品系。韓福光等[5]研究發現，未成熟胚的誘愈率在不含有鹽類物質的MS培養基中比含有鹽類物質的高，可達70.2%，最適處理時間為授粉后12～15 d，同時還研究不同濃度2,4-D對誘導的影響，結果表明不同濃度2,4-D誘導的結果不同，因此認為2,4-D濃度對結果有影響。白志良等[17]研究表明，幼胚誘導的成功率較低主要與胚齡相關，一般胚齡小于7 d的成功率很低，胚齡多余10 d的成功率較高。

1.2 成熟胚培養國外學者對利用成熟胚進行組織培養的研究較多。Bhaskaran等[18]首次利用高粱成熟胚誘導愈傷組織，并獲得成功。此后又有學者利用成熟胚小盾片誘導成功愈傷組織，并分化得到再生植株[19-21]。Cai等[22]以高粱成熟胚的芽端為對象，誘導愈傷組織，發現在現有MS培養基的基礎上，添加濃度150 mg/L L-Asn、5 mg/L KT和5種無機鹽，大大增加成功率，可見添加外源物質是增加誘導成功率的有效途徑。

國內對于利用成熟胚的研究較少，僅有少數學者進行相關研究。韓福光等[5]取幾種高粱類型的不同外植體在MS培養基上進行愈傷組織誘導培養，發現影響外植體愈傷組織形成和生長的因素很多，結果表明，不同基因型間愈傷組織誘導率有差異，耐性(耐旱)品種形成愈傷組織能力較強，不同外植體間誘愈率差別較大，幼穗誘愈率最高88.0%，花藥最低1%左右。另外，幼葉誘愈培養對鹽反應敏感，在成熟胚培養過程中，其誘愈率為63.0%,并獲得8棵成株。白志良等[17]研究表明，成熟胚的最高出愈率達100%。石太淵等[23]認為基因型和培養基對高粱成熟胚離體培養均有較大影響。

2 幼葉培養

對于利用幼葉誘導愈傷組織的研究國內外已有報道，Wernicke等[24]用葉齡10 d的高粱幼苗幼葉為對象，將其接種在MS培養基上，35 d后得到愈傷組織，后得到再生植株。Sairam等[25]利用8個不同遺傳來源的高粱品系，選取生長18 d幼苗的幼葉，提取其葉肉細胞后，接種在添加2,4-D和NAA的MS培養基上進行液體培養，得到愈傷組織后，在MS固體培養基上接種，僅2個品種能分化得到再生植株，誘導率為25%。韓福光等[5]選取距離生長點0.1～1.0 cm的幼葉，先切成1～2 mm段，研究有鹽和無鹽條件下對誘導愈傷組織的影響，結果表明在有鹽的MS培養基上的誘愈率小，在無鹽的MS培養基上所獲得的誘愈率大。在相同條件下，不同品系間誘導率也不同。上述的研究均是在MS培養基上進行的，對于其他培養基的研究未見報道。

3 莖尖培養

Nahdi等[26]選取11個不同遺傳來源的高粱品系的莖尖，培養后的成功率最低為0，最高為91%，可見不同遺傳背景的品系其誘導率不同，表明基因型對結果的影響巨大。Seetharama等[27]認為利用3個高粱品種的莖尖進行誘導，結果與Nahdi等[26]的類似，再生率不同，平均為14%，其中僅有2個品種的再生率為18%以上。白志良等[17]先切取長0.5 cm的切段進行誘導，其出愈率為11%左右，說明在莖尖培養中無菌芽的長度非常重要，當芽長小于2 cm時，培養效果隨芽長的減小而變好，但并非越小越好，切取芽的長度還應進一步研究。

4 幼穗培養

國外學者Beretl等[28]于1980年進行幼穗培養成功。此后George等[29]、Cai等[30]和Kaeppler等[31]針對不同的材料運用相同的技術，即以幼穗為外植體誘導愈傷組織，進而獲得再生植株，均獲得成功。說明利用幼穗誘導愈傷組織簡便易行，成功率高，植株生長速度快。

國內學者[5，17，32]也做了大量的工作，結論與之相同。其中，韓福光等[5]在幾種不同高粱培養基配方基礎上添加一定濃度的2,4-D和KT，與不添加2,4-D和KT的培養基相比，出愈率明顯提高，由8%提高至10.0%，說明培養基的配方對結果有較大影響，并要注意取材時間。

5 花藥培養

Rose[33]對不同基因型的高粱花藥進行培養，僅得到白化幼苗。錦州市農業科學研究所[34]選取花藥分化發育期的4分體期、單核早期、單核晚期和雙核期接種，結果表明，出愈率0.55%,分化出36株綠苗，分化率為88 %。韓福光等[5]將花藥接種在MS和C17培養基上，發現有些材料僅在MS培養基上得到愈傷組織，有些在MS和C17培養基上均無法得到愈傷組織，說明材料的基因型和培養基類型均對培養結果有重大影響。

6 種子培養

Maralappanvar等[35]在MS培養基中添加一定濃度的2,4-D，發現有2個品種愈傷組織誘導率較高，均在80%以上，如培養基中蔗糖含量達60 g/L以上，誘導率則更高，劉明等[36]在MS培養基中添加2,4-D和KT，同樣能提高誘導率，白志良等[17]認為種子的誘愈率為28%～93%，隨不同品種誘愈率有差異。

7 幼苗培養

Bhat等[21]利用萌發的無菌苗進行培養，愈傷組織誘導率僅為34.6%，且未能培養出再生植株。國外學者以無菌幼苗下的橫向薄細胞層進行培養，獲得成功，但試驗條件很高，重復性較差[36]。

8 原生質體培養

衛志明等[37]首次報道高粱原生質體培養成功，分別利用高粱植株幼穗胚性愈傷組織建立懸浮細胞系，分離原生質體，經培養獲得部分再生植株，田間的生長狀況良好。

9 胚乳培養

田立忠等[38]利用高粱未成熟胚乳在含有BA或2,4-D與KT組合的培養基上誘導啟動，誘導形成愈傷組織的適宜激素有以下3種：①2,4-D0.5 mg/L，NAA0.2 mg/L，BA0.7 mg/L，KT4 mg/L；②NAA0.5 mg/L，ZT1 mg/L；③2,4-D0.5 mg/L，KT1 mg/L，說明胚乳愈傷組織有較強的分生能力。

10 展望

高粱組織培養的成功受到許多因素的影響。不同基因型、不同培養基均存在差異；研究表明幼胚是理想的外植體,但取材有時間、部位限制；培養基中添加的外源物質也影響高粱愈傷組織誘導與再生。因此,必須對細胞內外多種調控因子的機理作深入研究,以最終揭示高粱再生細胞分化過程的本質。

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Application Progress of Tissue Culture in Sorghum

LIU Yong, WANG Liang-qun, YANG Wei et al

(Sorghum Institute of Shanxi Academy of Agricultural Sciences, Jinzhong, Shanxi 030600)

The research progress of sorghum tissue culture was introduced from aspects of embryo culture,young leaf culture,shoot tip culture,immature inflorescence culture,anther culture, seed culture,seedling culture,protoplast culture,endosperm culture. The development of sorghum tissue culture was forecasted.

Tissue culture; Sorghum; Application

劉勇(1976- )，男，山西榆社人，助理研究員，從事高粱新技術育種研究。

2015-03-05

S 514

A

0517-6611(2015)10-031-03