MARVELD1在腦膠質瘤中表達的實驗研究*

時毅敏魏川江唐世潔唐世平戴黎萌

MARVELD1在腦膠質瘤中表達的實驗研究*

時毅敏①魏川江②唐世潔②唐世平②戴黎萌③

目的：探討人腦膠質瘤組織中MARVELD1 的表達。方法：RT-PCR和Western blot技術檢測33例腦膠質瘤組織蛋白和mRNA的表達，并以11例正常腦組織為對照。結果：相較于正常腦組織，Ⅰ級、Ⅱ級、Ⅲ級、Ⅳ級腦膠質瘤組織中MARVELD1蛋白和mRNA的表達水平差異均有統計學意義（P＜0.05），Ⅲ級、Ⅳ級腦膠質瘤組織中MARVELD1蛋白和mRNA的表達水平低于Ⅰ～Ⅱ級腦膠質瘤組織和正常腦組織（P＜0.05）。結論：MARVELD1對腦膠質瘤惡性程度判斷有一定的指導意義，并為腦膠質瘤臨床治療提供了新的靶標。

腦膠質瘤； MARVELD1； 實驗研究

腦膠質細胞瘤是來源于神經上皮的顱內最常見的原發性腫瘤，占顱內腫瘤的40％～50％，膠質細胞瘤患者的治療主要以積極的手術、放、化療等治療措施為主，但該腫瘤多呈浸潤性生長，手術不易全切[1-2]。患者預后仍較差，WHO分級Ⅲ級的膠質細胞瘤患者平均生存期約3～5年，多形性膠質母細胞瘤患者平均生存期尚不足1年[3-4]，因此尋找新的腦膠質瘤治療靶點成為當前亟待解決的難題。MARVELD1基因是定位于人類10號染色體長臂10q24.2的一個新的候選抑癌基因，該基因在多種正常組織中表達，而在乳腺癌、肺癌、腎癌等多種癌癥中 MARVELD1基因的表達呈明顯下調[5-6]。因此本研究通過對不同病理級別腦膠質瘤組織中MARVELD1的表達，以期從MARVELD1在其發病機制中的調控作用，為腦膠質瘤的靶向治療提供新思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2013年1月-2014年4月入住本院神經外科的符合腦膠質瘤的患者33例。患者均為初發，術前未接受放、化療等治療，其中男18例，女15例，年齡7～70歲，平均（40.2±19.3）歲；星形膠質細胞瘤20例，少突膠質細胞瘤3例，室管膜細胞瘤5例，髓母細胞瘤3例，多形性膠質母細胞瘤1例，膠質肉瘤1例；按照2007年WHO神經腫瘤分類標準進行病理分級，其中I～II級15例，III級10例，IV級8例。另取11例來自同期收治的腦外傷或腦出血患者的正常腦組織標本作為對照，患者男6例，女5例，年齡16～47歲，平均（32.3±12.3）歲。兩組患者在性別、年齡方面比較差異均無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 主要儀器與試劑 熒光定量PCR儀及分析軟MXPro 4.01（Stratagene公司）；凝膠成像系統（柯達公司）。一抗兔抗人MARVELD1單克隆抗體（Abcam）；兔抗羊免疫熒光IgG二抗（美國Santa Cruz公司），TRIzol試劑盒（Gibco 公司），RT-PCR引物由Takara生物技術有限公司合成，逆轉錄-聚合酶鏈反應（RTPCR）試劑盒為公司產品。

1.3 檢測方法

1.3.1 標本采集 符合納入標準的腦膠質瘤的患者與11例健康正常者均收集手術切除的新鮮腦膠質瘤標本，標本均經病理確診，離體后0.5 h內轉至-80 ℃低溫冰箱凍存。手術切除后標本分成兩部分，一部分用于MARVELD1 mRNA的檢測，另一部分用于MARVELD1蛋白的檢測。

1.3.2 RT-PCR檢測腦組織 MARVELD1 mRNA表達 采用TRIzol 法抽提總RNA，將 RNA反轉錄成cDNA。取1 μL作為模板進行 RT-PCR反應。MARVELD1引物序列，上游：5'-GAGGAAGTAGATTGCTGCCTCTAG-3'；下游：5'-GAGAGCGGTCGGTGTGACCAGCTCTG-3'。β-actin引物序列，上游：ATGGG TCAGA AGGATTCCT ATGTG；下游：CTTCATGAGGTAG TCAGT CA GGTC。RT-PCR反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃延伸 1 min（30 cycle）；72 ℃終延伸10 min。

1.3.3 Western Blot檢測PBMC中MARVELD1蛋白的表達水平 取適當腦組織加入液氮快速研磨后，加入相應體積的裂解液，放置冰上充分作用30 min后；收集裂解物入，4 ℃離心30 min，-80 ℃凍存。采用蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測MARVELD1 蛋白的變化，進行SDS-PAGE凝膠電泳，轉膜與封閉，一抗及二抗孵育。在凝膠成像儀上掃描條帶，以其和內參β-actin灰度值的比值來反映其相對含量。

1.4 統計學處理 采用SPSS 16.0統計軟件對數據進行分析，計量資料以（±s）表示，比較采用t檢驗，計數資料采用 χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 腦膠質瘤組織與健康正常腦組織mRNA的提取 瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，腦膠質瘤腦組織Ⅰ～Ⅱ級、Ⅲ級、Ⅳ級與健康正常腦組織總RNA均可見清晰的18S和28S條帶，說明總RNA純度基本達到實驗要求，且樣品保存質量較好無明顯降解；對提取的mRNA用紫外分光光度計測量A260/A280值為1.8～2.0，說明mRNA總量及質量滿足實時定量熒光RT-PCR的要求。

2.2 腦膠質瘤腦組織與健康正常腦組織標本中MARVELD1mRNA水平的表達差異 為驗證MARVELD1在腦膠質瘤組織中的表達情況，用RT-PCR檢測MARVELD1 mRNA的表達，如圖1、表1所示，相較于正常組織，MARVELD1 mRNA在腦膠質瘤Ⅰ～Ⅱ級、Ⅲ級、Ⅳ級組織中相對表達降低，且Ⅲ級和Ⅳ級組織低于Ⅰ～Ⅱ級，差異均有統計學意義（P＜0.05），表示MARVELD1 mRNA在腦膠質瘤組織中特異表達顯著下調。本實驗均以β-actin為內參，應用商品化的引物，得到的溶解曲線為單峰，結果符合要求。

圖1 各組MARVELD1 mRNA水平的表達差異注：1 正常組織，2 腦膠質瘤Ⅰ～Ⅱ級，3 Ⅲ級，4 Ⅳ級

表1 各組MARVELD1 mRNA水平的表達差異

2.3 腦膠質瘤腦組織與健康正常腦組織標本中MARVELD1蛋白水平的表達差異 提取正常組織和腦膠質瘤Ⅰ～Ⅱ級、Ⅲ級、Ⅳ級組織的蛋白，用western bloting檢測MARVELD1蛋白的表達，如圖2、表2所示，MARVELD1在腦膠質瘤Ⅰ～Ⅱ級、Ⅲ級、Ⅳ級組織中相對表達降低，且Ⅲ級和Ⅳ級組織低于Ⅰ～Ⅱ級，差異均有統計學意義（P＜0.05），表示MARVELD1 蛋白在腦膠質瘤組織中特異表達顯著下調。

圖2 各組MARVELD1 蛋白水平的表達差異注：1 正常組織，2 腦膠質瘤Ⅰ～Ⅱ級，3 Ⅲ級，4 Ⅳ級

3 討論

MARVELD1 是癌癥發生及轉移的分子機制過程中發現的一個新的候選抑癌基因，其含有一個較為保守的膜相關結構域MARVEL （MAL and related proteins for vesicle trafficking and membrane link，具有囊泡運輸和膜連接功能的MAL及相關蛋白），MARVEL結構域的蛋白參與了clathrin調節的細胞內吞作用、細胞凋亡、突觸囊泡的融合、細胞的趨化活力、成肌細胞的融合和緊密連接等相關進程[7-8]。MARVELD1 mRNA全長3238bp，含有兩個外顯子，編碼區位于第一外顯子內，其編碼蛋白含有173個氨基酸，預測分子量約為18.9 kDa[9]。MARVELD1 蛋白定位于細胞核和線粒體中，而在細胞質中的含量很少[10]。

表2 各組MARVELD1蛋白水平的表達差異

MARVELD1作為一個新的候選抑癌基因，在多種正常組織中表達，而且與癌旁對照相比，P. M. Alves等通過大規模基因表達譜分析發現MARVELD1 在結腸癌中處于高表達狀態[11-12]。通過ONCOMINE網站的基因表達譜數據檢索發現MARVELD1 在男性生殖細胞腫瘤中的表達明顯高于正常的睪丸組織；在多形性膠質母細胞瘤、少突膠質細胞瘤以及星形細胞瘤中的表達則明顯低于正常腦組織；在前列腺腺癌中的表達也低于正常前列腺組織[13-14]。采用腫瘤表達芯片對19種不同類型的原發腫瘤樣本，系統分析了MARVELD1基因在多種人類原發癌中的表達情況，發現在154對病例中有69對（45％）MARVELD1基因在腫瘤組織中出現了表達下調，特別是腎癌、膀胱癌、乳腺癌、肝癌，以及卵巢癌、子宮癌、女性外陰癌、宮頸癌和睪丸癌等生殖系統腫瘤中MARVELD1基因的表達受到明顯的抑制[15-16]。

本研究發現，腦膠質瘤組織中MARVELD1蛋白和mRNA表達水平均低于正常腦組織，并且隨膠質瘤細胞分化程度的降低（ 病理級別的升高）而逐漸下降，表明MARVELD1基因表達下調可能是腦細胞發生惡性轉化的原因之一，提示MARVELD1可作為腦膠質瘤惡性程度判斷的輔助指標用于臨床。

綜上所述，通過檢測腦膠質瘤組織中MARVELD1的表達，可能對腦膠質瘤惡性程度及預后的判斷有一定的指導意義，并為腦膠質瘤臨床治療提供了新的靶標。

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Expression of MARVELD1 in Human Glioma Tissue

SHI Y i-min，WEI Chuan-jiang，TANG Shi-jie，et al.//Medical Innovation of China，2015，12（09）：037-039

Objective：To explore the relationship the expression of autophagy-related gene MARVELD1 in human glioma tissue. Method： Western blot and RT-PCR technology were used to detect the expressions of MARVELD1 protein and mRNA in 33 cases of glioma tissue and 11 cases of normal brain tissue. Result：There were significant differences in the expressions of MARVELD1 protein and mRNA among normal brain tissue grade Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ andⅣ glioma tissue（P＜0.05）. The expressions of MARVELD1 protein and mRNA in grade Ⅲ and grade Ⅳ glioma tissue were lower than those in grade Ⅰ， grade Ⅱ glioma tissue and normal brain tissue（P＜0.05）. The expression of MARVELD1 protein in grade Ⅰ and grade Ⅱ glioma tissue was lower than that in normal brain tissue（P＜0.05）. Conclusion： MARVELD1 of glioma malignancy judge has a certain significance， and provides a new target for the clinical treatment of glioma.

Glioma； MARVELD1； Experimental research

10.3969/j.issn.1674-4985.2015.09.012

2014-08-07） （本文編輯：蔡元元）

廣東省深圳市科技計劃項目（201203374）

①廣東省深圳市光明新區中心醫院 廣東 深圳 518107

②廣東省深圳市光明新區人民醫院

③廣東省深圳市人民醫院

時毅敏

First-author’s address：Shenzhen Guangming New District Central Hospital，Shenzhen 518107，China