超聲波輔助提取菠蘿皮中黃酮及其抗氧化性研究

(瓊州學院 理工學院，海南 三亞572022)

0 引言

黃酮類化合物是一類存在于自然界的、具有2－苯基色原酮結構的化合物.黃酮類化合物有廣泛的藥用價值，具有抗氧化、清除氧自由基、調節(jié)心血管系統作用［1－3］.并且具有抗菌、抗癌的作用以及降血糖的活性［4－5］.

菠蘿是世界名果之一，具有良好的營養(yǎng)價值和保健功效.菠蘿皮渣是菠蘿加工產生的副產物，占總重量的50%～60%，其中菠蘿皮約占30%［6］.如果不加以處理，將會對環(huán)境造成嚴重污染，也會對資源造成極大浪費.相關研究表明菠蘿皮中富含黃酮等抗氧化活性物質［7］，如果對其加以提取，在提高菠蘿廢棄物價值的同時，也增加了黃酮的來源途徑.

在黃酮類化合物的提取中，超聲提取技術、微波提取法和超臨界流體萃取技術等［8］是近年來文獻報道的一些廣泛應用的現代生物學技術.超聲波提取技術提取速度、提取率比傳統提取方法更快更高，且不受成分極性因素、分子量大小因素的限制;還具有操作簡單、所提取料液雜質含量少、有效成分容易分離和純化等特點［9］.Hromadkova［10］等人對比了傳統堿法和超聲輔助提取蕎麥中半纖維素的產率，證明經短時超聲波處理后產率相比于傳統方法分別提高了1.2－1.5 倍.劉平懷等［11］利用循環(huán)超聲波技術提取廢棄菠蘿皮中的色素，其提取時間大為縮短，色價和提取率都有較大幅度提高.

本文采用超聲波輔助提取菠蘿皮中黃酮類化合物，確定了最佳提取工藝，并研究了菠蘿皮黃酮的抗氧化性.充分開發(fā)利用我省的菠蘿皮渣廢棄物資源，提高其利用率.

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 實驗材料與試劑

菠蘿皮渣:收集市場新鮮菠蘿皮，處理后作為實驗原料.

無水乙醇、蘆丁標準品、氫氧化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化亞鐵、硫氰酸銨，均為分析純.

1.1.2 主要儀器和設備

電熱恒溫鼓風干燥箱(金壇市盛藍儀器制造有限公司);UV－2550 紫外可見分光光度計(島津制作所);TDL－80－2B 離心機(金壇市盛藍儀器制造有限公司);JU－6224 調節(jié)型超聲發(fā)生器(上海杰恩超聲設備有限公司)等.

1.2 實驗方法

1.2.1 菠蘿皮黃酮類物質的提取工藝流程

菠蘿皮渣→清洗→沸水熱燙滅酶10 min→60℃烘干→粉碎→過40 目篩→超聲輔助浸提→離心→上清→黃酮粗品.

1.2.2 菠蘿皮黃酮含量的測定

1.2.2.1 標準溶液的配制

準確稱取蘆丁0.0200 g 用60%乙醇配制成0.2000 mg/ml 標準溶液，備用.

1.2.2.2 最大吸收波長的確定

準確稱取1.0000 g 菠蘿皮渣干粉于錐形瓶中，加入60 %乙醇，搖勻并蓋上塞子，超聲輔助提取，功率為600W，時間為30 min.提取結束后抽濾，取濾液以3000 r/min 離心10 min.取3.0 mL 上清液，依次加入2.0 mL 5%的NaNO2溶液、2.0 mL 10% Al(NO3)3溶液，搖勻放置6 min，最后加入10 mL 4% NaOH 溶液，定容至50 mL，靜置20 min 后測量，蘆丁標準溶液也經相同的處理，分別在200－700 nm 進行光譜掃描.

1.2.2.3 蘆丁標準曲線的制作

分別準確吸取蘆丁標準液0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0ml，同1.2.2.2 的方法在最大波長344 nm 處測吸光值，得到的標準曲線回歸方程為:y=28.774x+0.0272，R2=0.9969.

1.2.2.4 黃酮含量的計算

取3 mL 待測液于50 mL 容量瓶中，同1.2.2.2 方法，在最大波長處測吸光值.將測得的吸光值代入回歸方程，通過下面公式計算樣品中黃酮類物質的提取率.

式中:c—樣品中黃酮化合物的濃度，mg/mL;

v1—黃酮粗提液總體積，mL;

v2—顯色反應定容體積，mL;

v3—測定取樣體積，mL;

w—樣品質量，g.

1.2.3 超聲輔助提取黃酮類物質的單因素實驗

1.2.3.1 超聲波功率對菠蘿皮黃酮提取率的影響

乙醇體積分數40%，料液比1∶50，分別于360、480、600、720、840W 功率下超聲25 min.

1.2.3.2 超聲時間對菠蘿皮黃酮提取率的影響

乙醇體積分數40%，料液比1∶50，于600 W 功率下分別超聲15、20、25、30、35、40 min.

1.2.3.3 提取劑濃度對菠蘿皮黃酮提取率的影響

料液比為1∶50，分別選用20%、30%、40%、50%、60%、70%體積分數的乙醇作提取劑，在600 W 功率下超聲25 min.

1.2.3.4 料液比對菠蘿皮黃酮提取率的影響

乙醇體積分數40%，分別選用1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70、1∶80 的料液比，在600 W 功率下超聲25 min.

1.2.4 超聲輔助提取黃酮類物質正交實驗

在單因素實驗研究的基礎上，選擇影響黃酮得率的四個主要因素，即:超聲功率(A)、超聲時間(B)、乙醇濃度(C)和料液比(D)，每個因素各選取三個適宜的水平，按照L9(34)設計正交實驗，見表1.

表1 菠蘿皮黃酮超聲波提取工藝正交實驗因素和水平表

1.2.5 菠蘿皮中黃酮類化合物的抗氧化性研究

參照俞堅［12］的方法，分別取4.00 mL 黃酮含量為24.93 mg/g 的待測樣品溶液置20 mL 具塞試管中，依次加入4.10 mL 亞油酸，、8.00 mL 磷酸緩沖液(0.05 mol/L，pH7.0)和3.90 mL 蒸餾水，混勻，在40℃放置30 min 后，取0.10 mL 上述反應液，依次加入9.70 mL 75%乙醇、0.10 mL 30%硫氰酸銨和0.10 mL 0.02 mol/L氯化亞鐵，混勻，準確反應3 min 后，測定500 nm 處的吸光值.以后每隔1 天取0.10mL 上述反應液，按同樣的方法測定500 nm 處的吸光值，直到空白對照組的吸光值達到最大.

2 結果與分析

2.1 菠蘿皮黃酮類物質紫外可見吸收光譜

圖1 蘆丁標準品和菠蘿皮黃酮的吸收光譜圖

菠蘿皮黃酮類物質和蘆丁標準品在200－700 nm 處掃描紫外—可見吸收光譜于圖1.由圖1可知，菠蘿皮黃酮類物質主要吸收峰集中在330－370 nm 之間，與蘆丁標準品的紫外吸收光譜相似，后續(xù)研究以最大吸收峰值的波長344 nm 為檢測波長.

2.2 單因素實驗結果和分析

2.2.1 超聲波功率對菠蘿皮黃酮提取率的影響

由圖2可知，超聲功率在360－600 W 之間時，隨著超聲功率的增大，黃酮的提取率明顯增加;功率大于600 W 時，黃酮含量明顯下降，這可能是因為超聲功率過高，提取溫度會發(fā)生較大波動，過大的能量產生的瞬間高溫往往會使熱不穩(wěn)定類黃酮類化合物分解或部分分解.因此超聲功率選用600 W 為宜.

2.2.2 超聲時間對菠蘿皮黃酮提取率的影響

圖2 超聲波功率對菠蘿皮黃酮提取率的影響

圖3 超聲時間對菠蘿皮黃酮提取率的影響

由圖3可知，超聲時間在10－15 min 范圍內，隨著提取時間的延長，菠蘿皮黃酮類化合物提取率呈線性增長，當提取時間達到25 min 時，黃酮得率最高，繼續(xù)延長提取時間，黃酮類物質的提取率呈下降趨勢，這可能是因為提取時間過長，超聲波的熱效應影響了黃酮類物質的化學結構;同時，提取時間過長會使雜質的溶出量增加，影響黃酮的提取率［13］.因此，提取時間選擇25 min 合適.

2.2.3 提取劑濃度對菠蘿皮黃酮提取率的影響

由圖4可知，在乙醇濃度為20－30%范圍內，隨著乙醇濃度升高，菠蘿皮黃酮提取率緩慢增加，在30－40%范圍內，菠蘿皮黃酮提取率呈線性增長，再增大提取劑濃度，提取率反而下降.因為低濃度乙醇，提取不充分，而且水溶性雜質易溶出，給后續(xù)的分離純化帶來困難.高濃度乙醇，提取過程中揮發(fā)嚴重，并且醇溶性雜質也增多，影響菠蘿皮黃酮的提取效果.

2.2.4 料液比對菠蘿皮黃酮提取率的影響

圖4 乙醇濃度對菠蘿皮黃酮提取率的影響

圖5 料液比對菠蘿皮黃酮提取率的影響

在相同超聲波提取條件下，隨著料液比的增加，菠蘿皮黃酮類化合物提取得率也不斷的提高，當料液比達到1:50 后，黃酮類化合物提取得率幾乎不再增加，料液比繼續(xù)增大后，黃酮提取率呈下降趨勢.初步推斷是因為料液比達到一定值后，黃酮類物質達到溶解平衡，同時雜質溶出量有所增加.

2.3 正交實驗結果與分析

按照表1安排試驗，正交實驗結果見表2

表2 正交實驗結果

通過表2的方差分析可知，在對菠蘿皮黃酮提取率影響較大的四個因素中，乙醇濃度的影響最大，其次是料液比，再次是超聲波功率，最后是超聲時間.最佳的提取工藝為A2B1C3D2，即超聲功率600 W，超聲時間20 min，料液比為1:60，乙醇濃度為40 %.在此條件下，菠蘿皮黃酮提取率可高達2.493%.

2.4 菠蘿皮黃酮類化合物抗亞油酸氧化能力

抗亞油酸氧化法是評價抗氧化能力的常用方法.脂質氧化的生成物主要是過氧化物，在酸性條件下，過氧化物把二價鐵離子氧化成三價鐵離子，三價鐵離子和硫氰酸根形成紅色的硫氰酸鐵，該絡合物在500 nm處附近有強的特征吸收，通過比色即可測出過氧化物的含量.吸光值越高表明亞油酸氧化程度越高［14］.從圖6可以看出菠蘿皮黃酮類化合物抑制了亞油酸氧化，可能是因為加入的黃酮醇及其苷能夠很好的抑制亞油酸過氧化物的形成，降低了過氧化物的形成速率.

圖6 菠蘿皮黃酮類化合物抗亞油酸氧化能力

3 結論

超聲波輔助提取菠蘿皮中黃酮類物質的最優(yōu)工藝條件為:超聲功率600 W，超聲時間20 min，料液比為1∶60，乙醇濃度為40%.在此條件下，菠蘿皮黃酮提取率可高達2.493%.黃酮類化合物具有抗氧化的生物活性，從菠蘿皮中提取的黃酮類化合物具有抗亞油酸氧化能力.

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