胃癌不同組織學分型與微血管密度及相關因子的關系*

呂靖芳 孫保存② 孫慧誌 張艷輝 孫俊英 趙秀蘭② 古強②董學易② 車娜②

·臨床研究與應用·

胃癌不同組織學分型與微血管密度及相關因子的關系*

呂靖芳①孫保存①②③孫慧誌①張艷輝③孫俊英①趙秀蘭①②古強①②董學易①②車娜①②

目的：探討微血管密度（microvascular density，MVD），基質金屬蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）、基質金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、血管內皮生長因子受體1（vascular endothelial growth factor receptor 1，VEGFR1）、血管內皮生長因子受體2（vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2）、p53蛋白與胃癌Lauren分型及WHO分型的關系。方法：收集89例胃癌患者的臨床數據并將其按照Lauren和WHO標準進行分型。應用單克隆抗體CD34/PAS雙重染色評價89例胃癌組織中的微血管密度，免疫組織化學法檢測標本中MMP-2、MMP-9、VEGF、VEGFR1、VEGFR2和p53蛋白的表達。結果：在胃癌中，MVD與Lauren分型和WHO分型均無相關性（P＞0.05）。Lauren分型與MMP-9、VEGFR1和p53有相關性（P＜0.05），與MMP-2、VEGF和VEGFR2無相關性（P＞0.05）。WHO分型與各腫瘤相關因子均無相關性（P＞0.05）。Lauren分型和WHO分型是胃癌患者獨立的預后因素（P＜0.05）。結論：對腫瘤相關因子、血管生成與胃癌發生、發展過程的研究，可能為不同組織學分型的胃癌患者提供新的治療方法。

胃癌 Lauren分型 WHO分型 微血管密度 p53MMP-2MMP-9VEGFVEGFR

胃癌是世界范圍內最常見的消化道惡性腫瘤之一，占腫瘤發生率的8%，腫瘤死亡率約10%，超過70%的新發和死亡病例出現在發展中國家［1］。胃癌的確診依賴于組織學分型，但現存的標準爭議較大。

WHO分型將胃癌主要分為管狀腺癌、乳頭狀癌、黏液腺癌和印戒細胞癌。Lauren［2］將胃癌分為三型：腸型、彌漫型和混合型，以前兩型為主。許多研究［2-4］發現胃癌不同組織學分型預后不同。本研究探討不同組織學分型的MVD差異并通過檢測p53、MMP-2、MMP-9、VEGF、VEGFR1和VEGFR2的表達，探討腫瘤相關因子在胃癌發生中的作用，為胃癌不同分型給予個體化治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病例資料 經研究對象或其家屬知情同意，收集2004年3月至2007年11月于天津醫科大學腫瘤醫院手術切除的89例胃癌標本。全部標本經10%中性福爾馬林固定、常規石蠟包埋，在顯微鏡下觀察H&E染色切片，選取典型腫瘤組織區域并4 μm連續切片備用。其中WHO分型中管狀腺癌51例，乳頭狀癌24例，黏液腺癌11例，印戒細胞癌3例。Lauren分型中腸型44例，彌漫型45例。所有患者術前均未行放療、化療及免疫治療。隨訪截止至2013年6月。生存期為診斷當日到患者死亡或隨訪截止日之間的時間。

1.1.2 主要試劑 VEGF鼠抗人單克隆抗體（ZM-0265）購自北京中杉金橋生物技術有限公司，濃度為1∶50；VEGFR1兔抗人單克隆抗體（ab-32152）購自美國Abcam公司，濃度為1∶250；VEGFR2兔抗人多克隆抗體（RB-1526-P0）購自美國Thermo公司，濃度為1∶50；MMP-2兔抗人多克隆抗體（10373-2-AP）購自美國Proteintech公司，濃度為1∶400；MMP-9鼠抗人單克隆抗體（MAB-0245）購自福州邁新生物技術有限公司，即用型；p53鼠抗人單克隆抗體（MAB-0142）購自福州邁新生物技術有限公司，即用型；CD34為鼠抗人單克隆抗體（ZM-0046）購自北京中杉金橋生物技術有限公司，濃度為1∶550；羊抗兔、羊抗鼠試劑盒（PV-6001，PV-6002）購自北京中杉金橋生物技術有限公司；DAB酶底物顯色試劑盒購自北京中杉生物技術有限公司。0.5%過碘酸和Schiff試劑由天津醫科大學病理教研室配置。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學法 石蠟切片常規脫蠟水化，蒸餾水沖洗，枸櫞酸緩沖液（pH=6.0）高壓修復，冷卻至室溫后蒸餾水沖洗，PBS浸泡5 min，加非免疫動物血清封閉30 min，除去非免疫動物血清，加適量一抗，4℃冰箱過夜，次日恢復室溫1 h后，PBS沖洗后每張切片加適量二抗，室溫下孵育90 min，PBS沖洗后DAB顯色，顯微鏡下觀察，持續5～10 min，自來水沖洗后蘇木素復染，常規梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固。

1.2.2 CD34/PAS雙染 石蠟切片脫蠟水化，蒸餾水沖洗，PBS浸泡5 min，枸櫞酸緩沖液（pH=6.0）高壓抗原修復2.5 min，3%H2O2消除內源性過氧化物酶15 min，蒸餾水沖洗，PBS沖洗后滴加一抗，4℃孵育過夜。次日PBS沖洗，滴加鼠二抗工作液，37℃孵育30 min，PBS沖洗后，DAB鏡下顯色后將切片置于0.5%過碘酸溶液中常溫孵育10 min，蒸餾水浸洗5遍，滴加Schiff試劑，37℃孵育15～30 min。流水沖洗，蘇木素復染細胞核，梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。

1.2.3 對照實驗 在每次染色流程中均按染色質量控制標準設有對照。陽性對照為陽性MMP-2、MMP-9、VEGF乳腺癌切片，陽性VEGFR2血管肉瘤切片，陽性VEGFR1、p53腸癌切片。陰性對照為PBS代替一抗。

1.2.4 免疫組織化學半定量標準 采用Mattern等［5］積分法，即分別評估該蛋白免疫染色的強度和范圍，并將每種評估內容均分成4個等級。染色強度積分：0為陰性；1為淺黃色；2為深黃色；3為棕黃色。標本選擇5個含有陽性細胞的高倍視野（×400），分別計數100個腫瘤細胞，取其平均值計數陽性細胞百分率。0為陽性細胞≤10%；1為陽性細胞≤30%；2為陽性細胞≤70%；3為陽性細胞＞70%。上述兩個獨立的評分相乘作為染色指數：0分為（-），1～3分為（+），4～6分為（++），7～9分為（+++）。（-）為低表達，（+）、（++）和（+++）為過度表達。

1.2.5 MVD計數方法 按文獻［6］判斷陽性結果，先在低倍鏡下（×100）尋找腫瘤內血管密度最高區，然后在高倍鏡下（×400）計數5個血管最高密度區的微血管數，其均值代表MVD。在腫瘤區域凡是染成棕黃色的單個內皮細胞或內皮細胞簇，與鄰近的微血管、腫瘤細胞或其他結締組織分開，作為一個血管計數。管腔直徑＞8個紅細胞或管壁有明顯肌層以及纖維硬化、炎癥及壞死的微血管均不計入總數。

1.3 統計學分析

采用SPSS 17.0軟件包進行統計學分析，計量資料采用t檢驗，計數資料采用χ2檢驗，單因素和多因素生存分析采用回歸分析法。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 MVD與胃癌不同組織學分型的關系

MVD與Lauren分型（P=0.604）、WHO分型（P=0.213）均無相關性（表1）。

2.2 腫瘤相關因子與胃癌組織學分型的關系

p53蛋白染色主要定位于胃癌細胞胞核，MMP-2、MMP-9、VEGF主要表達在腫瘤細胞胞漿和細胞膜，VEGFR1和VEGFR2主要位于腫瘤細胞的細胞漿和細胞膜，少數表達于基質血管中（圖1、2）。其與Lauren分型和WHO分型的關系見表2和表3。p53（P=0.042），MMP-9（P=0.020）和VEGFR1（P=0.044）與Lauren分型有關。各腫瘤相關因子與WHO分型均無相關性（P＞0.05）。

2.3 單因素分析及多因素分析

Cox單因素及多因素（表4）分析可知，對于患者總生存時間，Lauren分型（P=0.003）和WHO分型（P=0.004）均可以作為獨立的預后因素。

表1 胃癌病理分型與MVD的關系 x±sTable 1 Relationship between different pathological classifications and microvascular density in gastric cancer x±s

圖1 胃癌組織中微血管表達（CD34/PAS×400）Figure 1 Expression levels of microvessel density in gastric cancer（CD34/PAS×400）

表2 Lauren分型與不同腫瘤相關因子的關系Table 2 Relationship between Lauren classification and different molecular factors

圖2 p53、MMP-2、MMP-9、VEGF、VEGFR1和VEGFR2在胃癌中的表達（S-P×400）Figure 2 Expression of p53,MMP-2,MMP-9,VEGF,VEGFR1,and VEGFR2 in gastriccancer（S-P×400）

表3 WHO分型與不同血管生成相關因子的關系Table 3 Relationship between WHO classification and different molecular factors

表4 患者臨床特征與總生存時間的Cox單因素及多因素分析Table 4 Univariate and multivariate analyses of the prognostic factors of overall survival

3 討論

相對于西方國家，亞洲胃癌患者預后更差。我國每年約有30萬新發病例，近24.4萬人死于胃癌。目前，我國常用的組織學分型為Lauren分型和WHO分型［7］。本研究探討胃癌中新生血管及腫瘤相關基因與不同分型的關系，尋找胃癌不同組織學分型形成的可能的途徑，為臨床進行針對性治療提供理論依據。

Lauren［2］于1965年提出Lauren分型，將胃癌分為腸型、彌漫型和混合型。前兩者無論在整體結構或細胞結構上均存在差異。腸型胃癌是胃黏膜對環境因素或者Hp感染產生的一系列變化，從慢性胃炎、胃萎縮、腸化生到早期癌、浸潤癌以及遠處轉移［8］；呈高分化，多存在大管腔結構，伴乳頭形成；腫瘤細胞大且結構清晰，形態學上差異性大。彌漫型胃癌主要起源于非萎縮型胃炎，分化程度較差，少有腺體形成；細胞質松散，細胞形態單一。混合型兼具上述二者的特點。研究［2-4］指出Lauren分型對患者預后有指導意義，本研究中的多因素分析也認為其是胃癌獨立的預后因素（P=0.003），相比較彌漫型，腸型胃癌患者預后好。

世界衛生組織修訂的胃癌WHO分型是目前應用最廣泛的分型方法。常見類型包括管狀腺癌、乳頭狀腺癌、黏液腺癌和印戒細胞癌。管狀腺癌的特點是腫瘤主要由管腔構成。乳頭狀腺癌指癌組織形成腔隙，并且形成的乳頭向腔內突出。黏液腺癌指大量分泌的黏液堆積在腺腔內。印戒細胞癌的特點是胃癌彌漫浸潤性生長，腫瘤細胞的細胞核被胞漿內的黏液擠到細胞的一側，呈印戒狀。多因素分析顯示WHO分型也是胃癌獨立的預后因素（P=0.004），印戒細胞癌預后最差。

微血管密度是近年來的研究熱點，是反映腫瘤血管生成的重要指標。許多研究發現其高表達有助于腫瘤細胞適應機體內環境的變化而更宜增殖、浸潤和轉移［9-10］。

本研究中MVD與Lauren分型無相關性（P=0.604），彌漫型胃癌MVD值略高于腸型。其他研究也認為彌漫型胃癌中MVD值更高［11］，且差異有統計學意義，原因為彌漫型較腸型胃癌生長快、預后差［2］，這可能與其新生血管活性高，為腫瘤提供了養分和轉移通道有關。而Takahashi等［12］結論為腸型胃癌中MVD值更高，原因為發現部分正性血管生成因子在腸型胃癌中表達更高，促進了血管生成。本研究認為腫瘤有三種血管生成模式：內皮依賴性血管、馬賽克血管和血管生成擬態。而MVD主要代表內皮依賴性血管，彌漫型胃癌的不良預后可能與馬賽克血管和血管生成擬態更密切相關。本研究發現MVD與胃癌WHO分型無相關性（P=0.213），與部分相關報道［13-14］一致。

在眾多參與腫瘤血管生成的因子中，VEGF被認為是中心調節因子［15］，與多種信號通路相關。VEGF需要與受體識別結合發揮生物學作用，其中VEGFR2被認為是腫瘤新生血管的主要介導因子，而VEGFR1對惡性腫瘤生長具有更直接的作用［16］。本研究發現僅VEGFR1與Lauren分型有關（P=0.044），VEGF和VEGFR2均無統計學相關性。有研究也發現VEGF在彌漫型胃癌中表達率更高［11，17］，與本實驗結果完全一致。VEGF及其受體與WHO分型均無相關性，與張君紅等［14］研究一致。各項研究顯示胃癌的不同組織學分型與腫瘤新生血管和血管形成相關因子之間的關系尚不確定。這可能與樣本量的大小、檢測方法及評分標準不同有關。

p53基因分為野生型和突變型。野生型p53是迄今為止發現的與人類腫瘤關系最密切的抑癌基因［18］，是抗腫瘤生長、轉移相關的重要蛋白。當其突變時則失去了對細胞生長、凋亡、DNA修復的調控，易引起細胞癌變［19］。目前免疫組織化學測出的p53蛋白幾乎都為突變型［20-23］。本研究發現p53在腸型胃癌中的表達明顯高于彌漫型（50.0%vs.28.9%，P=0.042），與相關研究［24-26］一致。但p53與WHO分型無明顯相關性（P=0.231）。

腫瘤生長代謝的重要步驟是細胞外基質的降解、腫瘤細胞突破基底膜，轉移到其他部位［27］。MMPs是一類水解細胞外基質的蛋白裂解酶家族，與惡性腫瘤的不良預后有關［28］。MMP-2和MMP-9是其中最重要的兩種，均屬Ⅳ型膠原酶，能夠降解細胞外基質和基膜中的Ⅳ型膠原。本研究發現MMP-9在腸型胃癌中陽性率更高，差異具有統計學意義，而MMP-2無相關性。這可能因為MMP-9降解膠原的能力是MMP-2的25倍［29］，所以其更具代表性。二者與WHO分型無相關性。相關性的不同可以因樣本數量、環境或者基因型的差異來解釋［30］。此外，方法和技術如樣本的包埋時間，不同廠家生產抗體的敏感性、特異性，以及計數標準不同均有可能影響結果［31］。

綜上所述，隨著對腫瘤相關因子、血管生成以及胃癌發生、發展和轉移過程的深入研究可能為不同分型的胃癌患者提供新的治療方法。

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（2015-04-14收稿）

（2015-07-20修回）

（編輯：鄭莉）

Relationship of different histological classifications of
gastric cancer with microvessel density and related factors

Jingfang LV1,Baocun SUN1,2,3,Huizhi SUN1,Yanhui ZHANG3,Junying SUN1,Xiulan ZHAO1,2,Qiang GU1,2,Xueyi DONG1,2, Na CHE1,2

1Department of Pathology,Tianjin Medical University,Tianjin 300070,China;2Department of Pathology,General Hospital of Tianjin Medical University,Tianjin 300052,China;3Department of Pathology,Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital,Tianjin 300060,China.
This work was supported by the Key Project of National Natural Science Foundation of China(No.81230050),the National Natural Science Foundation of China(No.81172046 and 81173091),and the Innovation and Entrepreneurship Training System(No. 201210062001).

Objective:To investigate the correlations of Lauren classification and world health organization(WHO)classification of gastric cancer(GC)with microvascular density(MVD),matrix metalloproteinase-2(MMP-2),matrix metalloproteinase-9(MMP-9),vascular endothelial growth factor(VEGF),vascular endothelial growth factor receptor 1(VEGFR1),vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR2),and p53.Methods:The clinical data of 89 patients with GC were collected.The collected specimens were categorized on the basis of Lauren classification and WHO classification.CD34/periodic acid-Schiff(PAS)double staining was performed to validate MVD. Immunohistochemistry was conducted to investigate the expression levels of MMP-2,MMP-9,VEGF,VEGFR1,VEGFR2,and p53.Results: MVD was not correlated with Lauren classification or WHO classification(P＞0.05).Lauren typing was associated with the expression levels of MMP-9,VEGFR1,and p53(P＜0.05).WHO classification was not related to any of the factors(P＞0.05).Cox proportional hazards model revealed that Lauren classification and WHO classification were the prognostic factors of overall survival(P＜0.05).Conclusion:This research on tumor related factors,angiogenesis,and different classifications of GC may provide new methods to treat this disease.

gastric cancer,Lauren classification,WHO classification,MVD,p53,MMP-2,MMP-9,VEGF,VEGFR

10.3969/j.issn.1000-8179.20150394

①天津醫科大學病理教研室（天津市300070）；②天津醫科大學總醫院病理科；③天津醫科大學附屬腫瘤醫院病理科

*本文課題受國家自然科學基金重點項目（編號：81230050），國家自然科學基金（編號：81172046，81173091）和國家級大學生創新創業訓練計劃（編號：201210062001）資助

孫保存 baocunsun@aliyun.com

呂靖芳 專業方向為臨床病理學。

E-mail：tjlvjingfang@163.com