菊花嵌合體‘su-07’花色變異相關蛋白質的分離與鑒定

李 堅，蘇媚，孔周陽，閆俊芳，張萍萍，祁偉，談建中

(蘇州大學建筑與城市環境學院，蘇州市建筑與城市環境重點實驗室，江蘇蘇州215123)

花色是觀賞植物最重要的經濟性狀之一，花色的形成涉及體內復雜的生理代謝過程，受基因型及環境因素影響而呈現豐富多彩的花色表型［1］。近年來，有關觀賞植物花色變異機理的研究主要集中在核酸分子水平上，如采用定量PCR技術探討不同花色品種花色素代謝相關基因的差異表達情況［2－3］，而利用花色嵌合體進行差異蛋白質組研究相對較少。由于蛋白質組學技術在研究特定功能蛋白方面具有很強的針對性，能快速、直觀、全面反映植物組織或細胞內的蛋白質種類、表達水平、修飾狀態以及蛋白質之間的相互作用，有利于從整體水平上研究蛋白質的組成和調控規律［4］，迄今在擬南芥［5］、水稻［6］、玉米［7］等植物中已有較多研究。該研究供試的菊花花色嵌合體表現為紫紅－黃色鑲嵌，扦插繁殖時仍表現為嵌合性狀。為探討其花色變異的形成機理，筆者采用蛋白質凝膠電泳和生物質譜技術，分析與鑒定了嵌合花色相關的差異表達蛋白質，以便為闡明菊花花色變異的分子機理提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 植物材料 菊花花色嵌合體材料‘su-07’取自蘇州大學苗圃基地，在盛花期分別采取黃色和紫色花瓣，用蒸餾水洗凈后，濾紙吸干水分備用。

1.2 葉片和花瓣蛋白質的提取 分別取黃色和紫色花瓣各1 g，液氮研磨后，參照文獻［8］的方法提取蛋白質樣品，重懸于適量樣品緩沖液(8 mol/L尿素、2%CHAPS、15 mmol/L DTT、0.5%IPG Buffer)備用。

1.3 蛋白質的雙向電泳 雙向電泳的第1向為固相pH梯度等電聚焦電泳，采用IPGphor等電聚焦儀(GE公司)進行，IPG膠條長17 cm，pH3～10(NL)，蛋白質樣品上樣量為1 mg。水化時，用水化液(8 mol/L Urea，2%CHAPS，15 mmol/L DTT，0.5%IPG Buffer)補足至350 μl，根據 IPG 等電聚焦儀使用指南進行操作。等電聚焦結束后，IPG膠條平衡2次，每次 15 min。平衡緩沖液Ⅰ為 0.05 mol/L Tris-HCl(pH8.8)，6 mol/L Urea，30% 甘油，2%SDS，1%DTT;平衡緩沖液Ⅱ用1.25%碘乙酰胺代替DTT。第2向SDS-PAGE的聚丙烯凝膠濃度為12%分離膠，電泳結束后，采用考馬斯亮藍R250進行染色。

1.4 蛋白質點的質譜鑒定 采用2-DE圖像分析軟件Image Master 2D Platinum 5.0對凝膠圖譜進行分析，從中選取差異蛋白質斑點，委托上海中科新生命生物科技有限公司進行質譜分析和鑒定。

2 結果與分析

2.1 菊花嵌合體花瓣蛋白質的SDS-PAGE分析 供試的菊花花色嵌合體在不同枝條上發育形成2種不同顏色的花瓣，表現為“雙色花”與“雙色花瓣”類型，花色差異顯著。從花瓣蛋白質的SDS-PAGE圖譜看(圖1)，紫色花瓣與黃色蛋白質的種類和含量差異較大，如在黃色花瓣中(圖1P1)，分子量73 kD、22 kD左右的蛋白質組分表達量較高，并多了一種分子量66 kD左右的蛋白組分，而在14～31 kD的低分子量區域內蛋白質組分的表達量較低。與此不同的是，不同花色花瓣著生部位的葉片蛋白質種類和含量幾乎完全相同(圖1L1、L2)，說明兩者在基因表達方面并無差異。

2.2 菊花嵌合體花瓣蛋白質的雙向電泳分析 由于不同花色花瓣蛋白質的SDS-PAGE圖譜存在差異，該研究進一步應用雙向電泳技術對黃色與紫色花瓣的蛋白質組分進行了分離與鑒定，其雙向電泳結果見圖2。由圖2可知，花瓣蛋白質的2-DE分離效果良好，蛋白質斑點主要分布在等電點pI 5.0～9.0、分子量31～97 kD。在黃色和紫色花瓣2-DE圖像中，分別檢測到了500和523個蛋白斑點，其中匹配斑點474個，匹配率92.67%，其中表達量差異達到2倍及以上的蛋白斑點有139個。

2.3 花色相關差異蛋白質的質譜分析與鑒定 從表達差異2倍以上的斑點中，選擇16個表達量較豐富且分離效果良好的蛋白質斑點進行MALDI-TOF-TOF質譜分析，結果成功鑒定了其中的10個組分，可將其分為3種類型:①糖代謝相關蛋白，如甘油醛-3-磷酸脫氫酶、磷酸甘油酸變位酶、轉酮醇酶等;②花色素代謝相關蛋白，如黃烷酮-3-羥化酶、查爾酮異構酶;③基因調控相關蛋白，如富含甘氨酸RNA結合蛋白、真核翻譯起始因子、polyA結合蛋白等(表1)。

3 討論

表1 菊花花色差異相關蛋白質組分的鑒定結果

植物性狀是基因控制和環境影響的結果，而蛋白質既是基因表達的最終產物，也參與基因的表達和調控。在該研究中，供試材料的雙色花瓣具有相同的基因組結構，但2-DE圖譜顯示的蛋白質表達譜及表達量存在一定差異，鑒定的10個差異蛋白質分別涉及到糖代謝、花色素代謝及基因調控等生命過程。

在鑒定的差異蛋白質中，F3H、CHI和SAMS與花色素合成直接相關，其中F3H是花色素苷合成過程中的關鍵酶，影響原花青素、花色素苷等的形成［9］。在該研究中，F3H在紫色花瓣中顯示了特異表達的特征，表明嵌合花瓣在花色素苷合成代謝方面存在差異。其次，CHI是黃酮代謝途徑中一個關鍵酶，降低或抑制CHI活性會使花色苷合成途徑上游產物的積累和下游反應底物的缺乏［10］。在供試嵌合體的黃色花瓣中，CHI的表達量高于紫色花瓣，這與黃色花瓣的顯色特點有關。另外，還檢測到SAMS在紫色花瓣中的表達量明顯高于黃色花瓣，而SAMS是植物體內的甲基供體，參與植物的轉甲基反應［11－12］，且有研究表明隨著花色素甲基化和糖基化程度的增加，其共色效應也相應增加，從而加強花色素苷的呈色［13］，說明紫色表型與花色素苷的甲基化修飾有關。

此外，在鑒定的其他蛋白質中(表1)，磷酸甘油酸變位酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶及轉酮醇酶在糖代謝過程中起著重要作用［14］，但尚未見與菊花花瓣顯色差異相關的報道，推測與花色素的糖基化有關;此外，鑒定的蛋白質如富含甘氨酸RNA結合蛋白、Poly(A)結合蛋白、真核細胞翻譯起始因子涉及基因的表達調控，但對菊花嵌合體花色素合成相關基因表達的作用機理目前尚不清楚，有待今后進一步研究。

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