與胰島共培養誘導肌源性干細胞分化為胰島素分泌細胞的可能性研究

王欣燕617000四川省攀枝花市第二人民醫院內分泌科

與胰島共培養誘導肌源性干細胞分化為胰島素分泌細胞的可能性研究

王欣燕
617000四川省攀枝花市第二人民醫院內分泌科

目的：探討胰島與新生大鼠肌源性干細胞（MDSCs）在體外共培養誘導肌源性干細胞（MDSCs）分化為胰島素分泌細胞的可能性。方法：提取新生大鼠MDSCs原代細胞，行鑒定，取第2代MDSCs外源性綠色熒光蛋白（GFP）基因轉染。提取大鼠胰島，雙硫腙鑒定，胰島與GFP轉染的MDSCs共培養。另選單獨MDSCs培養為對照組。結果：共培養組第5天在顯微鏡下可見細胞團結構，第7天可見典型的胰島樣細胞團；雙硫腙鑒定細胞團：綠色團塊中有部分被染成猩紅色，說明猩紅色團塊來自MDSCs分化表。對照組未檢測到上述變化。結論：胰島與MDSCs共培養能誘導大鼠MDSCs跨胚層分化為胰島素分泌細胞。

成體干細胞；共培養；胰島；胰島素分泌細胞

糖尿病己成為發達國家中繼心血管病和腫瘤之后的第三大非傳染性疾病。干細胞可定向分化為胰島素分泌細胞的研究為糖尿病的治療提供了新的思路。除了通過不同培養條件進行體外誘導干細胞分化的方法外，還有用成熟體細胞與干細胞共培養同樣可以誘導干細胞定向分化[1]。本實驗旨在研究大鼠胰島與MDSCs共培養后誘導MDSCs分化成胰島素分泌細胞的可能。

資料與方法

動物：新生3d內SD大鼠，雌雄不限；5周齡SD大鼠，雌雄不限。

主要試劑：Ⅱ型分散酶，Ⅱ、V型膠原酶，雙硫腙（DTZ），小鼠抗大鼠Desmin抗體。腺病毒介導的外源性綠色熒光蛋白（GFP）基因。

方法：①MDSCs的原代培養：取新生3d內的SD大鼠乳鼠5只，無菌條件下取骨骼肌，剪成乳糜狀，消化、離心，棄上清，細胞團重懸，命名為PP1，置培養箱中。3h后將細胞懸液轉至另一個培養瓶，命名為PP2。相關實驗選用同批收集的PP2。②MDSCs的Desmin免疫組織化學鑒定：取PP2的MDSCs，把細胞接種在6孔板中的蓋玻片上。以同期PP1細胞作為對照組。按照試劑盒說明書行細胞免疫組織化學染色，予細胞計數板計數：Desmin染色陽性率=陽性細胞/總細胞。③大鼠胰島的分離、純化：5周齡SD大鼠，麻醉，開腹，取胰腺、消化液。消化液過濾、離心，去上清液，冰浴備用。另取一個離心管，緩慢加入Ficoll，再加入胰島懸液。離心，于不同濃度層交界間吸取胰島，洗滌，重懸于培養液，置培養箱中。④胰島細胞的DTZ染色，計數：將DTZ融于二甲基亞砜，再予稀釋，過濾。在胰島中加入DTZ工作液。按以下公式計數：胰島數=3次陽性細胞團總數/3×20×樣本量（mL）。⑤大鼠肌源性干細胞的GFP轉染：取第二代MDSCs接種于transewell底層，用腺病毒介導的外源性GFP基因轉染MDSCs，熒光顯微鏡下觀察。⑥MDSCs與胰島共培養：加培養液于transewell底層中的MDSCs。將約400個胰島放進transewell上層，加入同樣培養基，每3d換1次液。對照組為MDSCs單獨transwell培養。⑦第5、7天的誘導產物DTZ染色：方法同前。

結果

MDSCs的生物學特性：PP1接種2h后，倒置相差顯微鏡下發現部分細胞開始貼壁。差速后PP2貼壁后，倒置相差顯微鏡下其貼壁細胞呈短梭形、紡錘形或多角形，活性好，見圖1A。

MDSCs的Desmin免疫細胞化學染色結果：PP2傳至第二代的細胞培養3d后，行免疫細胞化學染色可見細胞質Desmin染色強陽性，陽性細胞率（80.35±0.91）％，見圖1B。

胰島分離、純化、鑒定結果：胰島懸浮于培養基中，由大小不一的胰島細胞組成。每只大鼠胰腺消化、純化后可獲得（102±32）個胰島，純度（82±1.53）％，DTZ染色，呈猩紅色。

共培養后誘導產物第5、7天DTZ染色：共培養第5天的誘導產物DTZ染色，有猩紅色團塊出現，但團塊小且結構松散（圖2A），共培養第7天，染成猩紅色的團塊增大且結構緊密（圖2B），單獨培養組染色未見猩紅色細胞團。熒光顯微鏡觀察聚集成團的團塊中有部分或全部顯示綠色，說明猩紅色團塊來自MDSCs分化。

討論

胰島細胞移植可以用來治療1型和部分2型糖尿病，但供體來源問題限制了它的廣泛應用[2]。尋找新的細胞來源成為當務之急，干細胞研究為此開辟了一條新途徑。目前認為，在體外通過成體干細胞與目的細胞共培養能在一定程度上“再現”體內微環境并成功地誘導干細胞定向分化[3]。Tomita等在未使用化學誘導劑情況下，將MSCs與新生鼠心肌細胞共同培養發現一部分GFP標記的MSCs出現自發性收縮[4]。在此理論基礎上，本實驗探討胰島與MDSCs共培養后誘導MDSCs分化為胰島素分泌細胞的可能性。

本實驗分離胰島細胞時采用了直接灌注法，具有胰島產出量高的特點[5]。并采用了Xu等人的Hank's液與聚蔗糖400配制成密度梯度介質[6]，進行胰島純化，純度可達83％左右。

GFP是一種在水母中發現的一種蛋白質，在藍光或近紫外光的照射下，不需加入任何反應底物或酶即可發射綠色熒光。GFP已成為一種監測體內基因表達，示蹤完整活細胞生命現象的重要報告基因[7]。因此，本實驗應用腺病毒介導將GFP基因轉染肌源性干細胞，使其攜帶示蹤標記，來證明共培養誘導的胰島素分泌細胞來自MDSCs。

圖1 MDSCs和MDSCs的Desm in免疫細胞化學染色

圖2 誘導產物DTZ染色

綜上所述，本實驗證實了大鼠胰島與MDSCs共培養能成功的誘導MDSCs分化為胰島素分泌細胞。為MDSCs治療糖尿病提供進一步的理論依據。

[1]Letty V,Hosoya K.Coculture of equinemesenchymal stem cells and mature equine articular chondrocytes results in improved chondrogenic differentiation of the stem cells [J].jpn.jvetRes,2010May,58（1）：5-15.

[2]Shapiro AM,Lakey JR,Ryan EA,et al.Islet transplantation in seven patients with type1 diabetesmellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen[J].N Engl J Med,2000,343（4）：230-238.

[3]Korecki CL,Taboas JM,Tuan RS,Iatridis JC. Notochordal cell conditionedmedium stimulates mesenchymal stem cell differentiation toward a young nucleus pulposus phenotype [J].Stem CellRes Ther,2010,1（2）：18.

[4]Tomita S,Nak atani T,Fuk uhara S,etal.Bone marrow stromal cells contract synchronously with cardiomyocytes in a coculture system[J]. Jpn J Thorac Cardiovasc Surg,2002,50（8）：321-324.

[5]Qiao AY,ZhangWH,Chen XJ,et al.Isolation and purification of islet cells from adult pigs [J].TransplantProc,2010,42（5）：1830-1834.

[6]Xu Y,Fu H,Wang Z,et al.Improved methods of isolation and purification of rat islets and its viability research[J].Zhongguo Xiu Fu Chong Jian Wai Ke Za Zhi,2010,24（4）：406-409.

[7]Yoo KJ,Li RK,Weisel RD,et al.Yau MD（2000）Heart cell transplantation improves heart function in dilated cardiomyopathic hamsters[J].Circulation,102：204-209.

The possibility ofmuscle-derived stem cells to differentiate into insulin-producing cellswas induced by co-culture of islet

Wang Xinyan
DpartmentofEndocrinology,The Second People's HospitalofPanzhihua City,Sichuan Province 617000

Objective：To investigate the possibility of the induction of muscle-derived stem cells（MDSCs）to differentiate into insulin-producing cells by isletandmuscle-derived stem cells in neonatal rats（MDSCs）which were co-cultured in vitro.Methods：The primary cells ofMDSCs in neonatal ratswere extracted and identified,exogenousgreen fluorescentprotein（GFP）were used to transfect MDSCs of the second generation.Rat pancreatic islets were extracted and then identified by dithizone,islets were co-cultured with MDSCs transfected by GFP.While only MDSCswere cultured as the controlgroup.Results：Cellmasswas found under amicroscope on the fifth days of the co-culture group,and typical pancreatic insulin-secreting cell clusterswas formed on the seventh day.Cell clusters identified by dithizone：a partof green cellswas dyed scarlet,which indict that scarletmass coming from MDSCs,but the same changeswere notdetected in the controlgroup.Conclusion：MDSCs in neonatal rats can be induced into differentiate insulin-producing cellsby co-cultureMDSCsand islets.

Muscle-derived stem cells；Co-culture；Pancreatic islets；Insulin-producing cells

10.3969/j.issn.1007-614x.2015.10.1