去甲斑蟊素對U87MG細胞增殖的影響

劉柏林 劉斌223300江蘇護理職業學院

去甲斑蟊素對U87MG細胞增殖的影響

劉柏林 劉斌
223300江蘇護理職業學院

目的：探討去甲斑蟊素對神經膠質瘤U 87MG細胞生物學行為的影響。方法：用MTT法檢測不同濃度的去甲斑蟊素對U 87MG細胞增殖的抑制作用。用ELISA實驗檢測血管內皮生長因子(VEGF)蛋白的表達水平。結果：MTT結果表明去甲斑蟊素對U87MG細胞的增殖有抑制作用，并隨濃度增加抑制作用增強；ELISA實驗提示去甲斑蟊素抑制U 87MG細胞分泌VEGF蛋白。結論：去甲斑蟊素可以抑制U 87MG細胞增殖，抑制腫瘤新生血管的形成。

神經膠質瘤；U 87MG；去甲斑蝥素；血管內皮生長因子

惡性膠質瘤是成人中樞神經系統最常見的原發性腫瘤，目前主要的治療方法是手術切除后輔助放療和化療[1]。近年來盡管其診斷技術不斷提高，治療方案不斷改進，但預后較差。因為膠質瘤呈現浸潤性生長，徹底切除將引起大腦嚴重損傷。因此，迫切需要新的治療方法，提高生存率。近期我們用去甲斑蝥素作用體外培養的人神經膠質瘤U87MG細胞系，研究其在神經膠質瘤中的治療作用。

資料與方法

實驗材料：人神經膠質瘤U87MG細胞系購自美國 American Type Culture Collection公司(USA)。U87MG生長在含有10％胎牛血清(FBS)和P/S溶液(10 000 U/ mL青霉素，10 000μg/mL鏈霉素)的DMEM培養基中。并在37℃、5％CO2、飽和濕度細胞培養箱培養。

藥品與試劑：去甲斑蝥素購自Sigma公司(St Louis，MO，USA)，溶解在二甲亞砜(DMSO)中使用。MTT購于Serva公司，用PBS配置成5mg/mL使用濃度，避光保存。DMEM培養基、二甲基亞砜(DMSO)、胎牛血清購于美國Gibico公司。VEGFELISA試劑盒購于德國IBL公司。

方法：①MTT法測定去甲斑蝥素對U87MG細胞增殖的影響：U87MG細胞接種于96孔板，接種密度5 000～6 000細胞/孔，約100μL，設置3個復孔；在37℃、5％CO2、飽和濕度細胞培養箱孵育24h后開始加入不同濃度的斑蝥素，空白對照組添加同等量的DMEM培養液，溶劑對照組添加同等量的1％ DMSO。繼續培養24h后，每孔加入10μLMTT(10mg/mL)試劑溶液，5％CO2，37℃溫育4h后，去掉孔內培養液，每孔加入200μL的DMSO液體，震蕩，用酶標儀測570nm波長處每孔的吸光度(A)值，結果重復3次。細胞增殖抑制率=[(對照組A值-處理組A值)/對照組A值]× 100％。②ELISA法測定去甲斑蝥素對U87MG細胞分泌VEGF的影響：根據MTT結果，實驗分組：空白對照組，12μmol/L斑蝥素組，96μmol/L斑蝥素組。將細胞接種在6孔板內，37℃溫箱培養，24h后，添加12μmol/L，96μmol/L去甲斑蝥素到相應孔中，空白對照添加同體積培養液體。繼續37℃溫箱培養24h，收集細胞上清于離心管，400g離心5min，吸去上清，保存于-80℃，備用。待上機檢測時取出。設立樣品對照，檢測樣品和標準品孔，然后分別將樣品對照品、檢測樣品和稀釋好的標準品100μL加入到相應的微孔中，37℃下孵育1h。吸出液體，然后洗滌。每孔加100μL酶標抗體(試劑空白對照孔外)，4℃下溫育0.5h，洗板9次。加底物顯色液100μL，37℃，避光，孵育0.5h。于各反應孔中加入2M硫酸50μL。在ELISA檢測儀上，檢測OD450值。

統計學分析：采用SPAS 16.0 for windows軟件包進行統計分析。各組之間的數據比較采用單因素重復測量資料的方差分析，所檢測數據用用(x±s)表示，檢驗水準α=0.05，當P＜0.05認為差異有統計學意義。

結果

MTT法測定斑蝥素作用24h后對U87MG細胞增殖的影響：分別用3～384 μmol/L濃度的去甲斑蝥素作用于U87MG細胞，24h后，MTT法測得去甲斑蟊素對U87MG細胞有明顯增殖抑制作用，而且隨去甲斑蟊素濃度升高，抑制率也相應增加，呈明顯的劑量效應關系，P＜0.05，見表1。

ELISA 法測定去甲斑蝥素對VEGF 的影響：ELISA 實驗提示空白組細胞VEGF 表達量明顯低于12μmol/L和96μmol/L斑蝥素組， 差異有統計學意義(P＜0.05)，實驗結果表明，斑蝥素能夠抑制U87MG 細胞分泌VEGF。

討論

現在研究表明斑蝥可以抗腫瘤，對肝癌、肺癌、卵巢癌、乳腺癌等多種腫瘤有治療作用。對其進一步研究，發現其還具有免疫抑制及升高白細胞的作用[2-3]。對于斑蝥抗腫瘤的機制，多名學者進行了深入研究。張衛東等研究發現[3]，斑蝥素可通過MAPK信號傳導途徑，降低ERK及phos-ERK的表達，使A549細胞增殖受到抑制。何太平等研究發現[4]，斑蝥素可能通過轉化生長因子β(TGF-β)信號傳導通路，磷酸化激活Smad后，Smad3與Smad4復合物與SBE結合，啟動相關靶基因的表達，從而抑制腫瘤的發生與發展。進一步研究發現斑蝥能有誘導細胞凋亡的細胞作用。另有研究斑蝥可以抑制腫瘤新生血管的生長。Lee YC等研究表明[5]，去甲斑蝥素通過阻斷VEGFR2/MEK/ERK信號通路，抑制VEGF的分泌，進而使腫瘤新生血管形成減少，其遷移、侵襲能力明顯下降。吳秋玲等也研究表明斑蝥可以降低MMP-9及VEGF的表達[6]，通過抑制腫瘤新生血管的生長，來抑制腫瘤生長。

筆者的研究中，ELISA實驗提示空白組細胞VEGF表達量明顯低于12μ mol/L和96μmol/L斑蝥素組，表明去甲斑蝥素能夠抑制U87MG細胞分泌VEGF。VEGF促進腫瘤新生血管形成，當VEGF分泌下降時，腫瘤新生血管形成減少，U87MG細胞遷移，侵襲力必然降低。MTT結果顯示，去甲斑蝥素處理組細胞吸光度值與空白組相比，出現了明顯的生長抑制現象，差異有統計學意義(P＜0.05)。上述結果與斑蝥素在其他腫瘤研究中的研究結果相一致。這些現象說明斑蝥素能有效抑制U87MG細胞的增殖能力，降低其產生腫瘤新生血管的能力，其具體作用機制還需要進一步研究。

綜上所述，斑蝥能明顯抑制U87MG細胞的增殖能力，降低其產生腫瘤新生血管的能力，對神經膠質瘤有一定治療作用，對其進一步研究，可為神經膠質瘤治療提供新的方法。

[1] Mannas JP，Lightner DD，Defrates SR，et al. Long-term treatment with temozolomide in malignant glioma[J].JClin Neurosci，2014，21 (1)：121-123.

[2]李森林，肖文海，黃巖.斑蝥的現代藥理研究和臨床應用[J].社區用藥指導，2007，9(109)：16.

[3] 張衛東，趙惠儒，宗志紅，等.斑蝥素通過MAPK信號傳導途徑對A549細胞增殖抑制作用的研究[J].腫瘤防治雜志，2004，11 (11)：1151-1153.

[4] 楊寰，強亞杰.斑蝥復方藥酒提物對小鼠肝癌H-22的治療作用研究[J].河南大學學報：醫學版，2013，32(4)：258-261.

[5] Lee YC，Lee LM，Yang CH，et al.Norcantharidin inhibits tumor angiogenesis via blocking VEGFR2/MEK/ERK signaling pathways[J]. Cancer Sci，2013，104(5)：604-610.

[6] 吳秋玲，盧宏達，郭繼龍，等.水蛭斑蝥對小鼠移植肉瘤血管形成的影響[J].中國中醫基礎醫學雜志，2012，18(6)：667-669.

Effectof norcantharidin on U87MG cellproliferation

Liu Bailin，Liu Bin
Jiangsu Nursing CareerAcademy223300

Objective：To explore the effect of norcantharidin on neuroglioma U87MG cell biological behaviour.Methods：The inhibition effects of different concentrations of norcantharidin on U87MG cell proliferation were detected by MTTmethod.The expression levelofvascular endothelialgrowth factor(VEGF)proteinwas detected by ELISA test.Results：MTT results showed that norcantharidin had inhibition effect on U87MG cell proliferation，and the inhibition effect increased with the increasing concentration.ELISA test showed that norcantharidin inhibited U87MG cell secretory VEGF protein.Conclusion：Norcantharidin can inhibitU87MG cellproliferation，inhibit the formation of tumorangiogenesis.

Neuroglioma；U87MG；Norcantharidin；Vascularendothelialgrowth factor

表1 MTT檢測去甲斑蟊素對U87MG細胞增殖抑制的作用(x±s)

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10.3969/j.issn.1007-614x.2015.22.1