酪酸梭菌與糞腸球菌的混合培養

柴虹　潘海珠　胡浩

摘要：為了確定酪酸梭菌與糞腸球菌混合培養方法，從2種菌接種順序及接種時間、混合培養基中碳源、氮源添加比例等方面進行了研究。結果表明，混合培養基中葡萄糖添加0.5%、酵母粉添加0.8%、酪酸梭菌接種混合培養基培養8 h后接種糞腸球菌、混合培養20 h后酪酸梭菌活菌數比單獨培養時稍高，芽孢率稍有下降；混合培養的糞腸球菌活菌數比單獨培養時大幅增加，為單獨培養時的2.4倍。

關鍵詞：酪酸梭菌；糞腸球菌；混合培養；動物腸道

中圖分類號： Q939.9 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2015）10-0279-02

酪酸梭菌又名丁酸梭菌，是農業部近幾年新批準使用的高安全性添加劑品種，該菌能調節動物腸道菌落平衡，抑制腸道有害菌生長[1-2]。該菌分泌的重要營養物質酪酸（丁酸）能修復受損傷的腸黏膜，促進其再生[3-5]。乳酸糞腸球菌是目前微生態制劑主要菌種之一，該菌可與動物腸道中有益微生物共生，具有改善動物胃腸道環境、促進動物生長和提高生產性能等作用[6]。這2種菌在動物飼養領域均具有很高的利用價值。通過長期的生產實踐，人們發現有些益生菌之間有共生作用，發酵產物可以互為利用，從而達到互利共棲的效果。已有研究表明酪酸梭菌與乳酸菌混合培養可顯著提高生物量和生理代謝功能，能產生優于純培養的效果。王松麗等研究表明，酪酸梭菌與鼠李糖乳桿菌混合培養生物量大幅提高，混合培養液對常見腸道致病菌具有更強的抑菌活性[7]。呂存女等試驗證明，酪酸梭菌與嬰兒雙歧桿菌兩菌聯合比單獨培養時顯示出更強的生物拮抗作用[8]。本試驗在2種菌單獨培養技術成熟的基礎上，嘗試將其混合培養，探索酪酸梭菌與乳酸糞腸球菌的共生關系。結果表明，兩者在混合培養基中表現出互惠共生的關系，其生物量均有提高。該方法用于大生產中可提高產率、降低成本，具有較高的實用價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 酪酸梭菌（Clostridium butyricum）JYS-1株、糞腸球菌（Enterococcus faecalis）JYS-2株，以上2個菌株為江蘇遠山生物技術有限公司實驗室保留菌株。

1.1.2 培養基

1.1.2.1 糞腸球菌計數培養基：蛋白胨3 g/L，胰酪蛋白胨17 g/L，酵母粉5 g/L，牛膽粉10 g/L，氯化鈉5 g/L，七葉苷1 g/L，檸檬酸鐵胺0.5 g/L，疊氮化鈉0.25 g/L，檸檬酸鈉1 g/L，瓊脂粉15 g/L；pH值6.9～7.3。

1.1.2.2 酪酸梭菌計數培養基：葡萄糖10 g/L，酵母粉8 g/L，氯化鈉2 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，瓊脂粉15 g/L；pH值 6.5 。

1.1.2.3 混合培養基：酵母粉8 g/L，氯化鈉5 g/L，葡萄糖5 g/L，磷酸氫二鉀2 g/L，碳酸鈣5 g/L，吐溫80（1 mL/L），硫酸鎂0.5 g/L，pH值7.0。

1.1.3 試驗儀器 pH計、立式壓力蒸汽滅菌器、鼓風干燥箱、超凈工作臺、恒溫培養箱、OXOID厭氧產氣罐、渦旋混合儀等。

1.2 方法

1.2.1 菌種接種順序及時間 酪酸梭菌單獨培養時，在接種菌種7～9 h后開始產氣，培養26～28 h時菌數和芽孢率均達到理想狀態。糞腸球菌單獨培養時無遲緩期，接種菌種后很快進入對數生長期，培養20～22 h后菌數達到最大值。根據以上生產經驗，本試驗分為4種組合，分別為：A：酪酸梭菌與糞腸球菌同時接種；B：酪酸梭菌培養6 h后接種糞腸球菌；C：酪酸梭菌培養8 h后接種糞腸球菌；D：酪酸梭菌培養10 h后接種糞腸球菌。分別對酪酸梭菌和糞腸球菌進行計數比較，并比較酪酸梭菌的芽孢率。

1.2.2 混合培養基主要成分的優化

1.2.2.1 葡萄糖 固定培養基中其他成分不變，改變葡萄糖濃度（0.2%、0.5%、0.8%、1.0%等4個梯度），根據酪酸梭菌和糞腸球菌活菌數確定葡萄糖最佳添加量。

1.2.2.2 酵母粉 固定培養基中其他成分不變，改變酵母粉濃度（0.2%、0.5%、0.8%、1.0%等4個梯度），根據酪酸梭菌和糞腸球菌活菌數確定酵母粉最佳添加量。

1.2.3 混合培養與單獨培養比較 確定好混合培養基的配方與混合培養方案后，單獨培養酪酸梭菌、單獨培養糞腸球菌、混合培養酪酸梭菌和糞腸球菌，將單獨培養和混合培養的酪酸梭菌和糞腸球菌分別計數，并進行比較。

2 結果與分析

2.1 菌種接種順序及時間

因酪酸梭菌是芽孢菌，穩定期相對較長，而糞腸球菌在穩定期后菌體衰亡較嚴重，故混合培養時間主要依據糞腸球菌培養時間來定。分別在混合培養18、20、22 h取樣進行活菌計數，結果見表1。由表1可以看出，同時接種酪酸梭菌菌種液與糞腸球菌菌種液，酪酸梭菌得不到充分的生長，酪酸梭菌培養6 h后接種糞腸球菌菌種液也是如此，酪酸梭菌培養10 h后接種糞腸球菌菌種液雖然酪酸梭菌數量較高，但酪酸梭菌芽孢率在后期相對于C組有所下降，同時糞腸球菌的數量也下降1個數量級，而酪酸梭菌培養8 h后接種糞腸球菌菌種液是最佳培養方案。

2.2 混合培養基主要成分優化結果

2.2.1 葡萄糖 葡萄糖添加量分為0.2%、0.5%、0.8%和1.0%4個梯度，培養基其他成分不變，酪酸梭菌培養8 h后接種糞腸球菌菌種液，混合培養20 h后采樣進行2種菌活菌計數。結果顯示，葡萄糖添加量在0.2%時菌數相對較少，0.5%、0.8%、1.0%菌數差別不明顯（表2），最終確定葡萄糖添加量為0.5%。

2.2.2 酵母粉 酵母粉添加量分為0.2%、0.5%、0.8%和1.0%四個梯度，培養基其它成分不變，酪酸梭菌培養8h后接種糞腸球菌菌種液，混合培養20 h后采樣進行2種菌活菌計數。結果顯示，酵母粉添加量在0.2%、0.5%時菌數相對較少，0.8%、1.0%菌數差別不明顯（表3），最終確定酵母粉添加量為0.8%。endprint

2.2.3 混合培養與單獨培養比較結果 由表4可見酪酸梭菌單獨培養26 h，活菌數1.5×108 CFU/mL，芽孢率92.4%。糞腸球菌單獨培養20 h，活菌數2.6×108 CFU/mL。酪酸梭菌培養8 h接種糞腸球菌菌種液，混合培養20 h，酪酸梭菌活菌數2.2×108 CFU/mL，芽孢率91.2%，糞腸球菌6.2×108 CFU/mL。該結果顯示，混合培養的酪酸梭菌活菌數比單獨培養時稍高，芽孢率稍有下降；混合培養的糞腸球菌活菌數比單獨培養時大幅增加，為單獨培養時的2.4倍。

3 分析與結論

實驗室范圍內酪酸梭菌與糞腸球菌的單獨培養工藝已經基本成熟。在此基礎上，合理安排2種菌的接種順序及接種時間，改善培養基中碳源、氮源的添加比例，最終達到高效混合培養2種菌的最終目的。因酪酸梭菌是芽孢菌，穩定期相對較長，而糞腸球菌在穩定期后菌體衰亡較嚴重，故混合培養時間主要依據糞腸球菌培養時間來定。試驗結果表明，混合培養基中添加葡萄糖0.5%，添加酵母粉0.8%，酪酸梭菌接種混合培養基培養8 h后接種糞腸球菌，混合培養20 h后酪酸梭菌活菌數比單獨培養時稍高，芽孢率稍有下降；混合培養的糞腸球菌活菌數比單獨培養時大幅增加，為單獨培養時的2.4倍。

參考文獻：

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[2]宋會儀，吳天星. 酪酸菌微生態制劑的生物學功能及在飼料中的應用[J]. 飼料工業，2006，27（12）：10-11.

[3]余國蓮，杜云平，梁健良，等. 丁酸梭菌培養條件優化[J]. 飼料廣角，2013（5）：31-32，50.

[4]李 妍，李拖平，孫勇勇. 培養條件對酪酸梭菌增殖生長的影響[J]. 食品工業科技，2013，34（18）：217-221.

[5]李 妍，李拖平，孫勇勇. 酪酸梭菌制劑的開發及在農業生產中應用的研究進展[J]. 農產品加工·學刊，2013，328（9）：63-65.

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[7]王松麗，凌華云. 一種丁酸梭菌與鼠李糖乳桿菌的混合培養方法[J]. 武漢大學學報：理學版，2009，55（5）：587-590.

[8]呂存女，鄺 欣，張雪平，等. 酪酸梭菌與嬰兒雙歧桿菌對艱難梭菌體外生物拮抗作用的研究[J]. 中國微生態學雜志，2001，13（4）：40-42.熊洪林，陳 嶙，楊 艷，等. 羅甸龍灘庫區網箱養殖現狀調查及對策探討[J]. 江蘇農業科學，2015，43（10）：281-284.endprint