觀察體外受精中卵泡液的抗氧化能力及其對卵母細(xì)胞質(zhì)量和胚胎發(fā)育的影響

梁琳，陳秀娟

（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院生殖中心，呼和浩特 010050）

活性氧（ROS）是細(xì)胞有氧代謝的產(chǎn)物，參與細(xì)胞增殖、凋亡、損傷修復(fù)等調(diào)控。機(jī)體抵抗ROS的能力稱為總抗氧化能力（TAC）。生理狀態(tài)下兩者保持動態(tài)平衡。TAC 在女性生殖中發(fā)揮著重要生理作用，但反映抗氧化能力的指標(biāo)測定及其對卵母細(xì)胞和胚胎質(zhì)量的影響結(jié)論不一。本研究以TAC、谷胱甘肽過氧化酶（GSH-PX）、巰基化合物（SH）、丙二醛（MDA）濃度作為檢測蛋白氧化損傷的指標(biāo)，探討卵泡液中蛋白氧化水平及TAC 與卵母細(xì)胞成熟度、早期胚胎發(fā)育及體外受精-胚胎移植（IVFET）妊娠結(jié)局的關(guān)系。

資料和方法

一、臨床資料

募集2011年3 月～5 月期間在我生殖中心行IVF-ET 不孕不育女性患者258 例，年齡24～39歲，平均年齡（31.60±4.55）歲，基礎(chǔ)性激素水平正常，既往無吸煙史，近期未使用過其他性激素藥物，未服用維生素類藥物，無其他內(nèi)、外科合并癥。

所有患者采用黃體期降調(diào)節(jié)長方案：于前次月經(jīng)周期第21～23 日注射長效醋酸曲普瑞林（輝凌，德國）1.250～1.875mg，降調(diào)時間為11～14d。于本次月經(jīng)周期第3～5 日注射重組人卵泡刺激素（rFSH，默克雪蘭諾，德國）進(jìn)行促排卵，起始劑量為150～300 U，并根據(jù)卵泡發(fā)育情況調(diào)整藥物劑量，用藥時間為8～16d。當(dāng)優(yōu)勢卵泡直徑≥18mm 時肌注人絨毛膜促性腺素（HCG，珠海麗珠）5 000U，并于用藥后36h于B 超引導(dǎo)下穿刺取卵。取卵日雌二醇（E2）值為（17 354.95±13 626.64）pmol／L；取卵日平均獲卵數(shù)為（14.49±7.32）枚。

行常規(guī)IVF 162例（IVF 組），其中輸卵管因素不育126例，男方少弱精子癥18例，子宮內(nèi)膜異位癥18例；行卵胞漿內(nèi)單精子注射（ICSI）96例（ICSI組），其中男方極度少精子及梗阻性無精子癥72例，補(bǔ)救ICSI 12例，獲卵數(shù)過少（新鮮周期獲卵數(shù)≤3枚）行ICSI 12例。

二、研究方法

卵泡液采集及指標(biāo)測定：選取卵巢內(nèi)直徑在18 mm 及以上的2 876個的卵泡，穿刺收集其清亮無血 液的 卵 泡 液，3 000r／min 離 心6 min 分 離 上 清液，-80℃低溫冰箱內(nèi)冷凍保存。采用化學(xué)發(fā)光法測定卵泡液中MDA（pmol／L）、總SH（μmol／L）、GSH-PX（U／L）和TAC（U／L）水平。檢測試劑盒由南京建成生物工程研究所提供，采用酶標(biāo)微板法檢測。

三、觀察指標(biāo)

觀察卵泡液中抗氧化能力和蛋白氧化水平與患者獲卵數(shù)、卵母細(xì)胞成熟率、正常受精率、卵裂率、優(yōu)胚率及妊娠結(jié)局間的相關(guān)性。IVF組卵母細(xì)胞成熟率＝受精后第2 日成熟卵母細(xì)胞數(shù)／獲卵總數(shù)×100%，正常受精率＝受精后第2日正常受精數(shù)／獲卵數(shù)×100%；ICSI組中卵母細(xì)胞成熟率＝取卵日去除顆粒細(xì)胞后成熟卵母細(xì)胞數(shù)／獲卵總數(shù)×100%，正常受精率＝受精后第2日正常受精數(shù)／成熟卵子數(shù)×100%。卵裂率＝正常卵裂胚胎數(shù)／正常受精數(shù)×100%；優(yōu)胚率＝優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)／可移植胚胎數(shù)×100%。優(yōu)質(zhì)胚胎標(biāo)準(zhǔn)為卵裂期胚胎評分在Ⅱ級以上的胚胎［1］。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料采用率（%）表示，計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)或t檢驗(yàn)，變量之間相關(guān)性研究采用相關(guān)性檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、卵泡液抗氧化能力和蛋白氧化水平與妊娠結(jié)局和胚胎發(fā)育的關(guān)系

患者平均卵母細(xì)胞成熟率為（91.58±10.96）%，正常受精率（63.42±20.12）%，卵裂率（95.34±11.81）%，優(yōu)胚率（47.89±27.61）%，平均冷凍胚胎數(shù)（5.67±5.27）個。妊娠組96例，未妊娠組162例，臨床妊娠率為37.2%。

在妊娠組和未妊娠組中，TAC、GSH-PX、MDA 和SH 水平的比較，均無顯著性差異（P＞0.05）（表1）。

比較抗氧化指標(biāo)與卵母細(xì)胞質(zhì)量及胚胎發(fā)育結(jié)局：在IVF 組中TAC 活力僅與獲卵數(shù)呈負(fù)相關(guān)（r＝-0.475，P＝0.012），SH 水平與優(yōu)胚率呈負(fù)相關(guān)（r＝-0.385，P＝0.047）。ICSI組中TAC 活力與獲卵數(shù)、受精及胚胎發(fā)育參數(shù)間無顯著性相關(guān)；GSH-PX 活力與卵母細(xì)胞成熟率呈負(fù)相關(guān)（r＝-0.505，P＝0.046）；MDA 與正常受精率呈正相關(guān)（r＝0.609，P ＝0.012），與 卵 裂 率 呈 負(fù) 相 關(guān)（r＝-0.541，P＝0.030）（表2）。整體上看，MDA 水平與正常受精率呈正相關(guān)（r＝0.371，P＝0.038），與優(yōu)胚率呈負(fù)相關(guān)（r＝-0.301，P＝0.050）；其他指標(biāo)與受精率的相關(guān)性不顯著；獲卵數(shù)與TAC 活力呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)（r＝0.338，P＝0.027）（表2）。

不同授精方式中取卵日雌激素水平與卵泡液的抗氧化能力和蛋白氧化水平的相關(guān)性：取卵日E2水平與抗氧化指標(biāo)間并不具顯著相關(guān)性（表3）。

二、不育原因與抗氧化指標(biāo)間的關(guān)系

考慮到不育因素與卵母細(xì)胞質(zhì)量及胚胎發(fā)育間的相關(guān)性，根據(jù)不育原因?qū)VF組患者分為輸卵管因素組、男方少弱精子癥組、子宮內(nèi)膜異位癥組；將ICSI組患者分為男方極少及無精子癥組（男方極度少精子及梗阻性無精子癥）和獲卵過少組（新鮮周期獲卵數(shù)≤3枚）兩組。比較5組間抗氧化指標(biāo)，結(jié)果顯示獲卵過少組MDA 水平與內(nèi)膜異位癥組、男方少弱精子癥組、男方極少及無精子癥組存在顯著性差異（P＜0.05）（表4）。

因患者年齡差別可能存在不同的抗氧化指標(biāo)的差異，故將患者按照年齡段分為＜31歲、31～＜37歲和≥37歲3組。觀察胚胎發(fā)育情況及抗氧化指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)抗氧化指標(biāo)在不同年齡組間無顯著性差異（P＞0.05），而31～＜37歲組的卵裂率較＜31歲組顯著增高（P＜0.05），其他獲卵情況及優(yōu)胚率在各年齡組間均無顯著性差異（P＞0.05）（表5）。

討 論

ROS的產(chǎn)生反映健康卵泡的代謝活性，在IVF授精后7～24h出現(xiàn)峰值，對胚胎分裂起著促進(jìn)作用。但是其活性升高會對卵母細(xì)胞成熟和后續(xù)胚胎發(fā)育造成不利影響，包括卵母細(xì)胞減數(shù)分裂停滯或凋亡，胚胎碎片含量升高及囊胚形成率過低等，稱為氧化應(yīng)激損傷［2］。已有研究表明，卵泡液ROS水平和總TAC 與卵母細(xì)胞成熟和早期胚胎發(fā)育的關(guān)系密切，可導(dǎo)致女性不孕癥的發(fā)生［3］。有學(xué)者認(rèn)為抗氧化劑的消耗對妊娠結(jié)局沒有預(yù)測價值，并證實(shí)TAC水平升高與不明原因不孕及多囊卵巢患者行IVF時卵子不受精有關(guān)，且各年齡段患者卵泡液中TAC含量差異不顯著［4］。同時也發(fā)現(xiàn)卵泡液中卵子與TAC 活性無相關(guān)性，TAC 的基線水平與抗氧化劑的消耗也不相關(guān)。因此TAC 對妊娠結(jié)局的預(yù)測能力有限。Appasamy等［5］證實(shí)，TAC 和卵巢反應(yīng)及其他反映妊娠結(jié)局的參數(shù)間不具顯著相關(guān)性，但低水平的TAC可增加移植前胚胎的生存能力。

本研究顯示，卵泡液的TAC 活性是變化的，與獲卵數(shù)呈負(fù)相關(guān)，提示TAC 可能在卵母細(xì)胞發(fā)育過程中起一定作用。但是從卵巢對Gn 的反應(yīng)上看，取卵日的E2水平與抗氧化指標(biāo)間無相關(guān)性，也未發(fā)現(xiàn)TAC與妊娠結(jié)局的相關(guān)性，因此可能不宜將其作為預(yù)測妊娠結(jié)局的指標(biāo)。邵麗等［6］認(rèn)為抗氧化能力與卵母細(xì)胞發(fā)育呈正相關(guān)，氧化水平與卵巢對FSH 的刺激反應(yīng)性呈正相關(guān)，而高氧化水平者發(fā)生卵巢過度刺激綜合征（OHSS）風(fēng)險增加。Pasqualotto等［7］未發(fā)現(xiàn)TAC 與卵母細(xì)胞成熟、受精卵分裂和胚胎質(zhì)量方面的相關(guān)性，僅發(fā)現(xiàn)TAC 水平若按照年齡分組后與妊娠率呈正相關(guān)。而本研究在4種抗氧化指標(biāo)按年齡分層分析后顯示，TAC 水平在不同年齡段均無顯著性差異。可能本研究中采用酶標(biāo)微板法測定TAC 水平的準(zhǔn)確性仍需要檢驗(yàn)，更精確的檢測手段需要進(jìn)一步探討。

表1 妊娠組和未妊娠組卵泡液中TAC、GSH-PX、MDA 和SH 水平的比較（±s）

表1 妊娠組和未妊娠組卵泡液中TAC、GSH-PX、MDA 和SH 水平的比較（±s）

組 別 例數(shù) TAC（U／L） GSH-PX（U／L） MDA（pmol／L） SH（μmol／L）妊娠組 96 5.82±1.46 131.51±19.79 3.08±1.14 872.47±97.23未妊娠組 162 5.33±2.04 118.00±33.07 2.98±2.14 796.47±193.59

表2 TAC、GSH-PX活力、MDA 和SH 水平及不同授精方式與卵母細(xì)胞質(zhì)量和胚胎發(fā)育結(jié)局的相關(guān)性

表3 不同授精方式中取卵日E2 水平與卵泡液的抗氧化能力和蛋白氧化水平的相關(guān)性

表4 不育原因各組間抗氧化指標(biāo)的比較（±s）

表4 不育原因各組間抗氧化指標(biāo)的比較（±s）

注：與內(nèi)膜異位癥組、少弱精子癥組、極少及無精子癥組比較，＊P＜0.05

組 別 例數(shù) TAC（U／L） GSH-PX（U／L） MDA（pmol／L） SH（μmol／L）輸卵管因素組（IVF） 126 6.10±4.62 122.50±30.29 2.72±0.84 829.65±189.63少弱精子癥組（IVF） 18 4.62±1.60 138.71±32.17 3.06±1.26 809.97±68.54內(nèi)膜異位癥組（IVF） 18 4.52±1.18 140.06±22.95 3.04±0.29 885.35±52.80獲卵過少組（ICSI） 24 5.39±2.38 122.18±13.63 2.16±0.41＊ 869.98±59.28極少及無精子癥組（ICSI） 72 5.43±1.83 128.43±21.20 3.89±2.53 859.31±96.72

表5 不同年齡段患者胚胎情況及抗氧化指標(biāo)的比較（±s）

表5 不同年齡段患者胚胎情況及抗氧化指標(biāo)的比較（±s）

注：與＜31歲組比較，＊P＜0.05

組 別 例數(shù) ICSI／IVF（n） 獲卵數(shù)（個） 卵母細(xì)胞成熟率（%） 受精率（%） 卵裂率（%）＜31歲 108 48／60 17.17±7.06 91.90±10.47 62.88±19.58 91.69±15.85 31～＜37歲 102 30／72 13.71±7.68 93.17±10.02 65.90±19.07 99.63±1.52＊≥37歲 48 24／24 1.13±4.91 87.48±14.13 59.36±25.12 94.45±11.88組 別 例數(shù) 優(yōu)胚率（%） 冷凍胚胎數(shù)（個） TAC（U／L） GSH-PX（U／L）MDA（pmol／L） SH（μmol／L）＜31歲 108 43.38±24.95 6.56±4.55 5.36±1.45 125.63±21.49 3.08±1.18 852.36±71.60 31～＜37歲 102 52.92±22.52 6.35±6.39 6.10±1.84 127.09±32.29 2.73±0.86 874.35±64.97≥37歲 48 47.32±42.29 2.25±2.49 5.28±1.86 127.12±2 3.52 3.60±3.00 761.74±302.44

GSH-PX 是機(jī)體清除氧自由基和ROS的主要酶類，在卵泡液中作為酶促類抗氧化物存在，成熟卵中GSH-PX 含量較高，GSH-PX 的合成可做為評價卵母細(xì)胞發(fā)育潛能的一種指標(biāo)［8］，若氧化反應(yīng)增強(qiáng)和抗氧化能力受損即會產(chǎn)生氧化應(yīng)激。卵母細(xì)胞周圍的顆粒細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能與卵母細(xì)胞發(fā)育相關(guān)，并參與GSH-PX 合成。動物實(shí)驗(yàn)表明，GSH-PX 在胚胎植入前囊胚階段的含量不到MⅡ期的10%［9］。在竇狀卵泡，卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞通過縫隙連接的通信對正常的卵母細(xì)胞和卵泡發(fā)育起著非常重要的作用［10］。本研究中，GSH-PX 活力在ICSI組與卵母細(xì)胞成熟率呈負(fù)相關(guān)，可能與ICSI時卵母細(xì)胞受精前去除顆粒細(xì)胞而導(dǎo)致GSH-PX 合成降低有關(guān)，成熟度高的卵母細(xì)胞與顆粒細(xì)胞依賴性關(guān)系會降低。但兩組不同授精方式隨后的胚胎發(fā)育程度與GSH-PX 含量均未見相關(guān)性。而Das 等［11］研究發(fā)現(xiàn)，GSH-PX 活性與妊娠率呈正相關(guān)。本研究因樣本量較少，故可能影響了其與妊娠率關(guān)系的判斷。

機(jī)體抗氧化系統(tǒng)中氧自由基能攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用，生成活性羰基類物質(zhì)MDA，影響膜蛋白和核酸的功能和代謝。目前廣泛用于氧化應(yīng)激水平分析的是對不飽和脂肪酸過氧化反應(yīng)（LPO）標(biāo)記物MDA 生成的測定，可間接反映細(xì)胞損傷的程度，因此MDA 是否對胚胎卵裂有影響值得探索。本研究觀察了MDA 水平與受精率和卵裂率的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)MDA 水平與正常受精率呈正相關(guān)，表明其對受精率影響有實(shí)際意義。MDA 與優(yōu)胚率呈負(fù)相關(guān)，在ICSI組中與正常受精率呈正相關(guān)，與卵裂率呈負(fù)相關(guān)。IVF 組中受精率與MDA 水平無顯著相關(guān)。表明過低的抗氧化能力會影響受精率和隨后的胚胎發(fā)育。Kazemi等［12］用MDA 作為氧化應(yīng)激標(biāo)記物，發(fā)現(xiàn)其與優(yōu)胚率呈負(fù)相關(guān)。這與本研究結(jié)果基本一致，但他們認(rèn)為MDA 與受精率間的關(guān)系不顯著。Celik等［13］的研究卻表明卵泡液中MDA 水平與受精情況及妊娠結(jié)局無關(guān)。Velthut等［14］認(rèn)為，子宮內(nèi)膜異位癥患者卵泡液中抗氧化能力減弱。本研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)膜異位癥患者M(jìn)DA 水平高于因男性因素行ICSI的患者，這可能因?yàn)閮?nèi)膜異位癥患者抗氧化能力減弱而導(dǎo)致氧化產(chǎn)物生成升高。

SH 參與維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原的正常狀況和蛋白巰基的功能狀態(tài)，并參與代謝調(diào)節(jié)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因表達(dá)的調(diào)控。Bedaiwy 等［15］認(rèn)為，SH 化合物會提高合子中GSH 的濃度，促進(jìn)胚胎發(fā)育到囊胚階段。Tatemoto等［16］認(rèn)為卵泡液中SH 檢測可反映出卵母細(xì)胞胞質(zhì)成熟度，SH 過低則會影響卵母細(xì)胞發(fā)育潛能。本研究中SH 檢測水平僅在IVF 組中與優(yōu)胚率呈負(fù)相關(guān)，可能其與胚胎發(fā)育之間有關(guān)聯(lián)。推測當(dāng)卵泡液內(nèi)受氧化損傷的蛋白增多會引起降解氧化蛋白的酶降低，從而影響細(xì)胞正常代謝過程，導(dǎo)致在受精、卵裂中起著重要作用的一些蛋白功能下降，故過高的SH 蛋白化合物也會對IVF結(jié)局起到負(fù)面作用，這與Lopes等［17］的研究相一致。

為探討抗氧化能力和氧化產(chǎn)物與卵母細(xì)胞受精率及妊娠結(jié)局間的關(guān)系，本研究分析了反映抗氧化能力的4 項(xiàng)指標(biāo)：TAC 和GSH-PX 活力及蛋白氧化產(chǎn)物MDA 和SH。GSH-PX 作為反映卵泡液抗氧化能力的標(biāo)志物，檢測其在卵泡液中的水平，可望為解決氧化損傷、改善早期胚胎質(zhì)量提供依據(jù)。卵泡液中各種氧化損傷標(biāo)志物與卵母細(xì)胞成熟度、胚胎的質(zhì)量以及受精和妊娠的相關(guān)性結(jié)論仍然存在爭議。本研究中雖然選取同一地區(qū)不孕不育患者納入統(tǒng)計(jì)，但生活習(xí)慣等易引起抗氧化指標(biāo)差異的因素并未予以考慮，這些因素也可能會對卵母細(xì)胞及胚胎質(zhì)量等造成一定程度影響，使結(jié)果產(chǎn)生偏倚，故氧化應(yīng)激與女性生殖的關(guān)系尚需要進(jìn)一步的研究和探討。

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