SEA聯合熱療對Hep-2細胞體外生物學行為的影響及相關機制

SEA聯合熱療對Hep-2細胞體外生物學行為的影響及相關機制

鞠洋許承弼江昌劉學識博杰辛丁

(吉林大學第二醫院，吉林長春130041)

摘要〔〕目的探討體外葡萄球菌腸毒素A(SEA)聯合熱療對人喉癌細胞株(Hep-2株)生長、增殖、凋亡等生物學行為的影響。方法應用四甲基偶氮唑藍(MTT)比色法檢測不同條件下對Hep-2細胞的增殖抑制率，流式細胞儀檢測Hep-2細胞周期進程的變化及凋亡率，透射電子顯微鏡檢測亞細胞結構改變。結果單純熱療組、單純SEA組及聯合組(SEA+熱療)對Hep-2細胞增殖抑制率分別 16.5%、25%和45.4%，與對照組相比差別有顯著意義；流式細胞儀結果顯示G0/G1期細胞增多，S期細胞減少，G2/M期細胞相對增多，且細胞凋亡率升高，組間比較差異顯著(P<0.05)。結論SEA聯合熱療能顯著提高Hep-2細胞的增殖抑制率，抑制G1期細胞向S期細胞轉化進程，誘導Hep-2細胞凋亡及亞細胞結構改變。

關鍵詞〔〕人喉頭癌細胞株；葡萄糖菌腸毒素A；熱療；細胞周期；凋亡

中圖分類號〔〕R739.4〔

通訊作者：辛丁(1963-)，男，教授，主要從事耳鼻咽喉頭頸腫瘤研究。

第一作者：鞠洋(1989-)，女，在讀碩士，主要從事耳鼻咽喉頭頸腫瘤研究。

手術及全身化療是目前喉癌治療的主要手段，但是多藥耐藥的產生嚴重影響化療效果及預后，是臨床亟待解決的問題〔1〕。因此，嘗試新的治療方法，防止多藥耐藥的產生，對提高喉癌的治療效果及生存率有重要意義。本研究應用超抗原葡萄糖菌腸毒素A(SEA)聯合熱療觀察其對喉頭癌細胞株Hep-2生物學行為的影響，旨在為喉癌的生物治療提供理論依據。

1材料和方法

1.1材料Hep-2細胞株由吉林省腫瘤研究所惠贈，(MTT)試劑及RPMI 1640培養基購于美國Sigma公司，SEA由軍事醫學科學院微生物流行病研究所提供；胎牛血清購于長春生物制品研究所。

1.2方法

1.2.1MTT比色法取對數生長期的Hep-2細胞，調細胞數為2×105/ml,接種于96孔塑料培養板內，100 μl/孔，當細胞增殖達到80%匯合時進行分組，單純熱療組43℃±0.2℃持續加熱40 min，然后移入37℃ 5%二氧化碳培養箱內靜止培養；單純SEA組，根據預實驗結果SEA最適量為40 ng/ml，聯合組在單純SEA組基礎上再加熱43℃±0.2℃ 40 min，然后移入5%二氧化碳培養箱內靜止培養2 h，于結束前6 h加入MTT試劑20 μl/孔，終濃度為500 mg/L繼續培養6 h后，吸棄上清加入二甲基亞砜(DMSO)150 μl，振蕩10 min,使MTT還原產物完全溶解，酶標儀于570 nm處測定各孔吸光度A值，按下列公式計算Hep-2細胞增殖抑制率。Hep-2細胞抑制率=(1-實驗孔細胞A值÷對照孔細胞A值)×100%

1.2.2流式細胞術細胞培養及分組同1.2.1，不同之處是將96孔塑料培養板改為25 ml培養瓶進行，培養結束后經0.25%胰蛋白酶消化，收集細胞磷酸鹽緩沖液(PBS)洗兩次，70%冷乙醇固定，上機前過40目網，調細胞數1×106/ml，碘化吖啶(PI)染色，流式細胞儀檢測，細胞周期結果以Modiff 2.0軟件分析。

1.2.3透射電子顯微鏡技術細胞培養及分組同1.2.2，收集不同條件下作用的Hep-2細胞，移入錐型離心管內，離心棄上清，應用2.5%戊二醛前固定，1%鋨酸后固定，梯度酒精脫水，環氧樹脂包埋，超薄切片，醋酸鉛-鈾雙重染色，透射電子顯微鏡觀察并拍照。

1.3統計學方法應用SPSS11.0軟件行t檢驗或χ2檢驗。

2結果

2.1MTT結果不同條件下對Hep-2細胞增殖均有抑制作用，與對照組相比差異顯著(P<0.05)，但聯合組效果明顯，兩者合用有協同作用。見表1。

組別A值抑制率(%)P值對照組1.52±0.12--熱療組1.27±0.1316.5<0.01SEA組1.14±0.1925.0<0.01聯合組0.83±0.1745.4<0.01

2.2流式細胞術不同條件對Hep-2細胞周期各時相的影響G0/G1期細胞增多，S期細胞減少，G2/M期相對增多，細胞凋亡率升高，組間比較差異顯著(P<0.05)。見表2。

組別G0/G1SG2/M凋亡率對照組29.4±2.664.2±3.56.4±1.22.0熱療組42.7±3.41)38.7±4.11)18.6±2.41)9.21)SEA組48.4±5.11)32.2±3.31)19.4±1.71)13.41)聯合組58.5±3.41)19.6±4.41)21.9±2.41)19.51)

與對照組比較：1)P<0.05

2.3透射電子顯微鏡結果單純熱療組Hep-2細胞超微結細胞膜破裂，有空泡形成，細胞高度空化，聯合組細胞核染色質趨邊凝集，可見凋亡小體。見圖1。

熱療組

SEA組

聯合組

圖1電子顯微鏡下Hep-2細胞結構改變(×5 000)3討論

腫瘤熱療被稱為是繼手術、放療、化療和生物治療后的第5種腫瘤治療方法〔2〕。熱療不僅對腫瘤細胞有直接的細胞毒效應，而且還可以增強放療化療的療效，提高機體的免疫力，因而被國際抗癌組織稱之為“腫瘤綠色療法”。MTT實驗可準確反映活細胞數量及細胞活化狀態。因此被廣泛用于抗腫瘤藥物篩選和細胞毒性實驗研究，具有一定的客觀性。

文獻報道〔3〕，熱療可改變細胞周期的兩個調控點，一個位于G1-S轉折點，控制細胞生長前期(DNA合成期)，另一個調控點位于G2/M期轉折點，是決定細胞一分為二的控制點。結果顯示，熱療可抑制G1期細胞向S期的轉化進程，從而使G1期細胞增多，S期細胞減少，造成G2/M期細胞相對增多，G2/M期細胞增多是細胞損傷的普遍反映〔4〕，這一點從細胞凋亡率上得到證實。SEA是一組對熱穩定的可溶性蛋白質，能抵抗胃腸液中蛋白水解酶的水解作用，是食物中毒和毒素性休克的常見病因〔5〕。SEA殺傷腫瘤有兩種途徑：一是直接細胞毒效應，二是間接殺傷腫瘤細胞，不需加工直接與(MHC)Ⅱ類分子形成配體，通過配體抑制細胞的增殖，由于SEA對熱穩定，所以聯合熱療應用優于化學藥物。

綜上所述，SEA具有直接的細胞毒效應，尤其是喉癌屬于腔內淺表腫瘤，應用SEA可直接腔內灌注或瘤體內注射，避免全身使用毒副作用的產生。因此，SEA聯合熱療用于喉癌的治療有廣闊前景。

4參考文獻

1Chen SJ，Luan J，Zhang HS，etal.EGFR-mediated G1/S transition contributes to the multidrug resistance in breast cancer cells〔J〕.Mol Biol Rep,2012;39(5):5465-71.

2高惠，楊耀琴.熱療與生物治療的聯合抗腫瘤效應〔J〕.國際腫瘤學雜志,2009;36(3)：193-5.

3Lim CU,Zhang Y,Fox MH,etal.Cell cycle dependent apoptosis and cell cycle blocks induced by hyperthermia in Hl-60 cells〔J〕.Int J Hyperthermia,2006;22(1): 77-91.

4Petrovic V,Costa RH,Lau LF,etal.FoxM1 regulates growth factor-induced expression of kinase-interacting stathmin (KIS) to promote cell cycle progression〔J〕.J Biol Chem,2008;283(1):453-60.

5李進，孫穎，李峰.因子Ⅶ-金黃色葡萄球菌腸毒素A融合蛋白的抗腫瘤效果〔J〕.中華腫瘤雜志,2005;27(8)：471-4.

〔2013-10-07修回〕

(編輯袁左鳴)