電針督脈穴對去卵巢大鼠骨組織的保護作用研究

鄭雪峰，聶焱，黃樞，林燕萍

（1.福建中醫藥大學針灸學院，福建福州350122；2.福建中醫藥大學附屬福州市中醫院，福建福州350001；3.福建中醫藥大學附屬人民醫院，福建福州350004）

實驗研究

電針督脈穴對去卵巢大鼠骨組織的保護作用研究

鄭雪峰1，聶焱2，黃樞3，林燕萍1

（1.福建中醫藥大學針灸學院，福建福州350122；2.福建中醫藥大學附屬福州市中醫院，福建福州350001；3.福建中醫藥大學附屬人民醫院，福建福州350004）

目的研究電針督脈穴對去卵巢大鼠骨組織的保護作用。方法6月齡SPF級SD雌性大鼠30只，隨機分成造模組（20只）和假手術組（10只）。造模組大鼠術后3個月，抽簽法隨機分為模型組、電針督脈治療組，各10只。電針3個月后，雙能X線骨密度儀測定各組大鼠全身骨密度（BMD），三點彎曲實驗測左股骨生物力學的性能，右側股骨HE染色做組織形態學分析。結果治療組治療后骨密度均明顯增加，大鼠骨生物力學性能最大載荷和斷裂載荷值均增高，骨組織形態結構中骨小梁結構、排列有序，寬度增加，無明顯骨小梁斷裂，Tb.Ar、Tb.N和Tb.Th均升高，Tb.Sp降低。結論電針督脈能夠增加去卵巢大鼠的骨密度，增加大鼠骨生物力學性能，改善骨組織形態結構。

絕經后骨質疏松；電針；督脈；穴位；實驗研究

絕經后骨質疏松癥（postmenopausal osteoporosis，PMOP）是指因卵巢功能衰退，雌激素水平降低等多種原因共同導致的單位體積內骨量減少、骨組織顯微結構改變的代謝性骨病［1］。目前PMOP居于常見病、多發病中的第七位，現在患病人數已超過2億。隨著世界人口老齡化的進程加速，預計骨質疏松的發病率會繼續上升，其帶給社會和家庭的危害也將日益嚴重。目前，藥物治療仍是國內外治療PMOP的最主要手段，但長期持續應用，大多數都有一定的毒副作用［2］。近年來針灸治療骨質疏松癥的方法越來越豐富，已從傳統的針刺、艾灸、天灸、耳針、穴位敷貼等發展到了現代的電針、穴位注射、紅外灸療儀等等，針灸治療骨質疏松癥的方法與療效已逐漸被臨床所驗證［3-5］。本研究在前期針灸治療PMOP臨床療效觀察基礎上，通過建立去卵巢大鼠骨質疏松模型，觀察電針對去卵巢大鼠的骨密度、生物力學性能及骨組織形態結構的影響。

1 材料與方法

1.1 材料華佗牌一次性不銹鋼針（中國蘇州醫療儀器廠，規格：直徑為0.30 mm，長度為25 mm）；SPF級6月齡雌性SD大鼠30只（上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供）；戊巴比妥鈉粉末（美國sigma公司）；

1.2 方法

1.2.1 絕經后骨質疏松動物模型的建立造模組：大鼠行雙側卵巢切除術，主要步驟如下：采用2%戊巴比妥鈉（2 mL／kg）麻醉后，消毒手術區域，切開腹腔，找到“Y”形子宮后，沿子宮探及子宮末端左右兩側卵巢，行完全結扎切除術。逐層縫合后，肌注青霉素（8萬μ／只）。根據課題組前期大量的動物造模實驗經驗，按照此方法造模，可以建立絕經后骨質疏松動物模型。假手術組：打開腹腔找到雙側卵巢，但不切除，而是切除卵巢周圍同等體積大小的脂肪組織，其余操作同造模組。

1.2.2 動物分組及干預

1.2.2.1 動物分組6月齡SPF級SD雌性大鼠30只，隨機分成造模組20只和假手術組10只。造模組大鼠術后3個月，抽簽法隨機分為2組：即模型組10只、電針督脈治療組10只（下稱治療組）。

1.2.2.2 動物干預假手術組不給任何治療措施，模型組造模后，不給任何治療措施。治療組具體治療方法如下：①取穴：命門、脊中（參照《實驗針灸學》實驗動物常用腧穴簡圖［6］）；②操作方法：a.電針操作：于每天上午8∶00-10∶00，常規消毒后，將針呈90°刺入上述穴位皮下達脊間韌帶層后，不行任何提插、捻轉手法；b.“脊中”穴接治療儀正極，“命門”穴接治療儀負極；c.電針刺激參數：采用HAN ACYTENS韓氏電針治療儀（WQ-1002F），輸出參數：疏密波，頻率2／100 Hz（電針頻率為2 Hz時為方型波，持續3 s，100 Hz時為方型波，持續3 s，電針儀自動在2 Hz和100 Hz之間交替轉換）。電針強度以小鼠肢體微顫為度。電針持續時間20 min／（只／次），每日1次，連續針刺10次為1個療程，療程間休息5 d，再行下1個療程。共針刺6個療程，持續90 d。

1.2.3 動物取材及標本制備干預結束后，處死實驗動物，進行標本采集。各組取材前24 h禁食，但可自由飲水。各組大鼠測定骨密度后，腹主動脈取血，常溫放置1 h后，3 000 r／min離心15 min，取上清液，－80℃冰箱保存備用；分離各組大鼠雙側股骨、L1椎體、L2椎體，仔細剔除其上軟組織，將右側股骨標記后置于4%多聚甲醛固定；其余骨骼用濕生理鹽水紗布包裹后于－80℃超低溫冰箱冷凍備用。

1.2.4 骨密度檢測大鼠稱重，2%戊巴比妥鈉（40mg／kg）麻醉后，運用雙能X線骨密度儀提供的小動物骨密度測定軟件，測定大鼠全身骨密度。測量時要確保被測大鼠四肢處于外展位，防止骨骼在掃描窗內重疊。

1.2.5 骨生物力學檢測將各組大鼠左側股骨從－80℃冰箱中取出，立即置于37℃水浴，保持生理鹽水濕潤；復溫后，采用三點彎曲法測定骨生物力學大小，主要步驟如下：將標本放置于島津萬能材料試驗機上，各個股骨統一按照股骨頭凹面朝下、股骨頭端朝前的位置放置，壓頭在股骨中間位置正上方，調節壓頭至其最接近股骨的位置但不觸碰到股骨。儀器設定：跨距24 mm，壓力加載速度1 mm／min，加壓直至股骨斷裂。通過計算機分析得出生物力學指標：最大載荷和斷裂載荷值。最大載荷：股骨斷裂前所能承受的最大力；斷裂載荷：股骨斷裂時所承受的力。

1.2.6 光鏡觀察各組大鼠骨組織形態學變化右側股骨標記后置于4%多聚甲醛固定，脫鈣后常規石蠟包埋，切片后HE染色，在光鏡10×4倍視野下每個病理片拍3張，運用病理圖像分析系統（Leica CW4000）對骨組織每張病理照片先用全自動圖像分析系統直接測出，再運用國際通用的公式計算測出的參數：骨小梁面積百分數、骨小梁厚度、骨小梁數量和骨小梁分離度，觀察病理形態學變化，最后取其平均值。靜態參數計算方法見表1，計算公式見表2。

表1 靜態參數參數、單位及測量方法

表2 靜態參數計算公式

1.3 統計學處理實驗數據采用SPSS 16.0進行分析。2組比較使用t檢驗，多組數據比較采用單因素方差分析。P＜0.05為有顯著性差異，P＜0.01為有非常顯著性差異。

2 實驗結果

2.1 電針對去卵巢大鼠骨密度影響結果如圖1。

圖1 電針對PMOP大鼠骨密度的影響

2.2 電針對PMOP大鼠骨生物力學的影響見圖2。

2.3 電針對PMOP大鼠骨組織形態學的影響假手術組中骨小梁豐富，結構完整，骨小梁數目多，骨小梁寬度較寬，連接緊密，未見骨小梁斷裂（圖3 A）；而模型組骨小梁開始出現稀疏，骨小梁之間出現斷裂，骨小梁寬度變窄（圖3 B）；經過電針督脈治療后，治療組可見較完整的骨小梁結構，骨小梁排列有序，寬度增加，無明顯骨小梁斷裂（圖3 C）。

圖2 電針對PMOP大鼠最大載荷、斷裂載荷的影響

圖3 HE染色觀察各組骨組織形態結構（40×）

與假手術組比較，模型組骨小梁面積（Tb.Ar）、骨小梁數目（Tb.N）和骨小梁厚度（Tb.Th）均降低，骨小梁分離度（Tb.Sp）升高；與模型組比較，治療組Tb.Ar、Tb.N和Tb.Th均升高，Tb.Sp降低，見圖4。

圖4 骨形態計量學變化

3 討論

3.1 電針對PMOP大鼠骨密度影響骨密度測量部位選擇主要是根據目前臨床上雙能X線測定方法最常用部位確定的，股骨近段和腰椎（L1～L4或L2～L4）是研究和測量骨量、骨密度的主要骨骼區域，因其測量的敏感性和準確性較高［7］。研究也發現：雌性大鼠整體BMD與在體和離體L3～6的BMD具有較好的一致性［8］。所以本實驗采用全身骨密度的測定來反映骨丟失情況。

本研究結果發現：模型組動物骨密度明顯低于假手術組，P＜0.05說明動物造模是成功的；治療組骨密度均明顯增加，與模型組比較，具有顯著性差異，說明電針督脈對PMOP具有治療作用。

3.2 電針對PMOP大鼠骨生物力學影響骨生物力學研究骨組織在外界作用下的力學特性和骨在受力后的生物學效應，是評價骨質量最有說服力的指標之一。骨礦含量的增加，骨質量并不一定相應增加，有時反而降低，因此，進行骨生物力學研究是評定骨質量和抗骨丟失療效的最佳方法。朱慧鋒等學者［9］提出OP發生時骨量減少與骨結構改變，均可直接影響骨的生物力學特性，降低骨的力學強度。因此，骨生物力學性能的改變，可作為評價骨OP及治療有效性的一個重要指標。研究［10-12］發現：最大載荷和斷裂載荷直接反映松質骨骨小梁的骨質、結構的連系性、皮質骨的強度、骨的橫截面積的大小等，是對骨質量的綜合反映。

為進一步證實電針對PMOP的治療作用，本研究同時觀察了電針對PMOP大鼠骨生物力學性能的影響，研究結果表明：與假手術組比較，模型組最大載荷和斷裂載荷值降低，說明模型的復制是成功的；與模型組比較，治療組最大載荷和斷裂載荷值均增高，進一步證實電針督脈對PMOP有積極的治療作用。

3.3 電針對PMOP大鼠骨組織形態結構影響骨組織形態計量學［13］屬體視學、生物醫學組織形態計量學中的一個特殊分支。骨形態計量學參數包括靜態參數與動態參數，分別用于不同情況的評價。該方法主要包括以下三方面內容：①可以用形態學定性地描述骨組織結構改變；②靜態學參數主要反映骨組織結構的靜態情況，定量地計算出骨小梁面積、骨小梁厚度、骨小梁間距、骨小梁數目等靜態學參數；③動態參數主要反映骨形成與骨吸收過程的動態變化過程。通過活體四環素標記，將四環素與骨特異結合并沉積于骨，從而把時間因素標記在骨的重建過程中。

本項目完成骨靜態計量學方面的研究，發現假手術組骨小梁豐富，結構完整，數目較多，寬度較寬，連接緊密，少量空骨陷窩，未見骨小梁斷裂；與假手術組比較，模型組骨小梁開始出現稀疏，骨小梁之間出現斷裂，寬度變窄，出現較多空骨陷窩，骨小梁面積（Tb.Ar）、骨小梁數目（Tb.N）和骨小梁厚度（Tb.Th）均降低，骨小梁分離度（Tb.Sp）升高，差異具有統計學意義；經過電針督脈后，治療組可見較完整的骨小梁結構、排列有序、寬度增加，較少出現空骨陷窩，無明顯骨小梁斷裂，Tb.Ar、Tb.N和Tb.Th均升高，Tb.Sp降低，差異具有統計學意義，表明電針督脈對PMOP均有治療作用。

［1］SEIFERT-KLAUSS V，FILLENBERG S，Schneider H，et al.Bone loss in premenopausal，perimenopausal and postmenopausal women：results of a prospective observational study over 9 years［J］. Climacteric，2012，15（5）：433-434.

［2］SIRID E S，SELBY P L，SAAG K G，et al.Impact of osteoporosis treatment adherence on fracture rates in North America and Europe［J］.Am J Med，2009，122（2 suppl）：S3-13.

［3］劉獻祥，吳明霞，吳炳煌，等.針灸對原發性骨質疏松癥影響的實驗和臨床研究［J］.中國骨傷，2000，13（9）：519-521.

［4］周曉莉，劉品莉，姜青松，等.“雙固一通”針法治療絕經后骨質疏松癥的臨床研究［J］.中國骨質疏松雜志，2008，14（3）：204-207.

［5］周曉莉.“雙固一通針法”對絕經后骨質疏松癥患者的臨床研究［D］.武漢：湖北中醫學院，2005.

［6］WHO.Technical Report Series No.921.Prevention and management of osteoporosis［S］.Geneva：WHO，2003.

［7］閏景龍，戴克戎，趙雅君，等.卵巢切除對大鼠皮質骨結構和力學性能的影響［J］.中國骨質疏松雜志,2001，7（1）：22-25.

［8］潘芳芳，周志華，王永平，等.針藥并用對絕經后骨質疏松癥大鼠血清E2、骨密度的影響［J］.上海針灸雜志,2012，31（6）：444-446.

［9］張娜，廖二元，王聞博，等.雌性大鼠全身骨密度與腰椎骨密度的一致性研究［J］.中華內分泌代謝雜志,2002，18（2）：120-122.

［10］朱慧鋒，程金海，王珠美，等.去卵巢大鼠干預后骨生物力學研究［J］.中醫正骨，2009，21（8）：5-7.

［11］陳夢詩，賴勝祥，李良，等.大鼠的骨生物力學指標選取及測試［J］.生物醫學工程雜志,2001，18（4）：547-551.

［12］史念珂，富東慧，蔡霞.大鼠骨生物力學實驗研究［J］.天津大學學報,2006，39（4）：458-462.

［13］DALLE CARBONARE L，VALENTI M T，BERTOLDO F，et al.Bone microarchitecture evaluated by histomorphometry［J］. Micron，2005,36（7/8）：609-616.

R245-0

A

1000-338X（2015）04-0040-03

2015-06-15

鄭雪峰（1975-），男，副教授。主要從事骨質疏松癥的中西醫基礎和臨床研究。