RRLC-MS／MS法測定栝樓桂枝顆粒中γ-氨基丁酸和瓜氨酸含量

陳阿虹，劉杰，許文,2，李煌，陳嫻雯，蘇世德，褚克丹，徐偉

（1.福建中醫藥大學藥學院，福建福州350122；2.福建中醫藥大學生物醫藥研發中心，福建福州350122）

RRLC-MS／MS法測定栝樓桂枝顆粒中γ-氨基丁酸和瓜氨酸含量

陳阿虹1，劉杰1，許文1,2，李煌1，陳嫻雯1，蘇世德1，褚克丹1，徐偉1

（1.福建中醫藥大學藥學院，福建福州350122；2.福建中醫藥大學生物醫藥研發中心，福建福州350122）

目的采用快速液相色譜-串聯質譜法（RRLC-MS／MS）測定栝樓桂枝顆粒中γ-氨基丁酸和瓜氨酸含量。方法采用RRLC-MS／MS法，以極性AQ-C18柱為色譜柱，以乙腈-0.1%甲酸水（5∶95）為流動相。質譜采用電子噴霧離子源（ESI）進行離子化，正離子模式下采集，選擇以多反應監測（MRM）對這2種氨基酸的母離子及子離子進行檢測，三重四級桿質譜進行定量分析。結果γ-氨基丁酸與瓜氨酸在0.265 0～10.60 μg／mL和0.019 6～9.800 μg／mL范圍內與峰面積呈良好線性關系，平均樣品加樣回收率分別為99.4%和102.4%，RSD%分別為2.24%和1.85%。結論RRLC-MS／MS法測定栝樓桂枝顆粒中γ-氨基丁酸和瓜氨酸的含量，方法簡便、準確、穩定，重復性好。

栝樓桂枝顆粒；γ-氨基丁酸；瓜氨酸；RRLC-MS／MS；含量測定

栝樓桂枝湯來源于東漢末年張仲景的《金匱要略》［1］，由天花粉、白芍、桂枝、生姜、甘草及大棗6味藥組成。目前，源于栝樓桂枝湯的顆粒劑經新藥申報批準為福建省中醫藥大學附屬第二人民醫院院內制劑（批準文號：閩2013S0001），在臨床上用于腦卒中后康復治療［2-3］，尤其對腦卒中后軀體痙攣患者療效顯著，現代藥理研究［4-11］表明栝樓桂枝湯具有顯著的神經保護作用。

處方中君藥天花粉含有大量氨基酸，其中γ-氨基丁酸和瓜氨酸是主要的具有生理調節作用的物質。2010年版中國藥典僅用瓜氨酸對天花粉進行定性鑒別，并無定量鑒別方法。本文采用RRLCMS／MS法同時測定栝樓桂枝顆粒中γ-氨基丁酸和瓜氨酸的含量，為建立栝樓桂枝顆粒的質量評價標準提供實驗依據。

1 儀器與材料

Agilent 6410快速液相色譜與串聯三重四級桿質譜聯用儀（美國Agilent公司）；乙腈（德國Merke公司）；Millipore超純水（美國Millipore公司）；CPA225D型十萬分之一分析天平（德國Sartorius公司）；數控超聲波清洗器（KQ-500DE，昆山市超聲儀器有限公司）；高速離心機（HC-2068，安徽中佳科學儀器有限公司）；瓜氨酸對照品（批號：110875-200506）購自中國藥品生物制品檢定所；γ-氨基丁酸對照品（批號：A104200）購自美國Sigma公司；栝樓桂枝顆粒（福建中醫藥大學附屬第二人民醫院院內制劑，生產批號：20140701、20140702、20140703）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件色譜柱：Ultimate AQ-C18柱（4.6× 100 mm，3 μm）；流動相為乙腈-0.1%甲酸水（5∶95），流速：0.3 mL／min，柱溫30℃。

2.2 質譜條件電噴霧離子源（ESI）；源噴射電壓2 500V；源溫度：350℃；正離子多反應監測（MRM）模式檢測。

2.3 樣品制備

2.3.1 供試品溶液制備精密稱取栝樓桂枝顆粒0.05 g，加超純水100 mL，超聲提取30 min，混勻，經0.22 μm微孔濾膜過濾，取續濾液，作為供試品溶液。精密量取稱取天花粉0.5 g，加超純水50 mL，超聲提取30 min，混勻，經0.22 μm微孔濾膜過濾，取續濾液，作為天花粉供試品溶液。

2.3.2 陰性桂枝湯制備按照栝樓桂枝顆粒制備工藝，制備缺失天花粉的陰性樣品，同法處理，制備成陰性樣品。

2.3.3 混合對照品溶液制備分別精密稱取γ-氨基丁酸和瓜氨酸10.6 mg和9.8 mg，用超純水溶解，定容到10 mL量瓶，搖勻，配置成質量濃度為1.060 mg／mL和0.980 0 mg／mL對照品儲備液。分別精密量取上述對照品儲備液適量，置同一10 mL量瓶中，加入超純水定容即得γ-氨基丁酸10.60μg·mL-1、瓜氨酸9.80 μg·mL-1的混合對照品儲備液。其他不同質量濃度的對照品混合溶液由混合對照品儲備液逐級稀釋，即得。

2.4 RRLC-MS／MS定量方法學考察

2.4.1 質譜測定方法采用MRM定量模式，2種分析物的質譜分析條件參數見表1。

表1 2種分析物質譜測定條件

2.4.2 專屬性考察精密量取混合對照品溶液、陰性對照溶液、供試品溶液和天花粉供試品溶液各5 μL，按上述色譜-質譜條件進樣。分別記錄色譜圖，2種成分混合對照品溶液（A圖）、陰性對照溶液（B圖）、供試品溶液（C圖）及天花粉供試品溶液（D圖），結果表明：陰性樣品在與對照品相同保留時間的位置上，無相應的色譜峰出現，說明其它組分不干擾該2種成分的測定，見圖2。

圖2 混合對照品及樣品色譜圖

2.4.3 線性關系考察取“2.3.3”項下方法制備的混合對照品儲備液，用超純水逐級稀釋配制一系列梯度濃度的對照品混合溶液，分別注入RRLC-MS／MS，按上述液質條件測定峰面積，記錄色譜圖與峰面積；以對照品峰面積（Y）為縱坐標，濃度（X）為橫坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程：

結果表明γ-氨基丁酸在0.265 0～10.60 μg／mL線性關系良好，瓜氨酸在0.019 6～9.800 μg／mL線性關系良好。

2.4.4 精密度精密吸取混合對照品溶液，按照上述液質條件，連續進樣5次，結果γ-氨基丁酸與瓜氨酸的色譜峰面積RSD平均值分別為2.74%和2.67%。

2.4.5 重復性實驗平行制備6份栝樓桂枝顆粒樣品，依法測定含量，γ-氨基丁酸與瓜氨酸平均含量分別為1.497 mg／g及4.201 mg／g，相對標準偏差（RSD）分別為3.74%和2.15%，表明方法重復性良好。

2.4.6 穩定性實驗精密吸取“2.4.2”項栝樓桂枝顆粒供試品溶液5 μL，在同一條件下分別在0、1、

2、6、8、12和24 h進樣，依法測定峰面積。結果γ-氨基丁酸與瓜氨酸峰面積的RSD分別為3.18%和2.89%，表明樣品在室溫條件下24 h內穩定。

2.4.7 加樣回收率實驗取重復性批次樣品0.025 g，按近似1∶1加入γ-氨基丁酸、瓜氨酸對照品溶液，依法制備供試品，測定，計算γ-氨基丁酸、瓜氨酸的加樣回收率，結果見表3。

2.5 樣品含量測定取栝樓桂枝顆粒，按2.3.1項方法制備樣品，按2.4.1項下質譜測定方法進行測定，計算含量，結果見表4。

3 討論

近年來，氨基酸的測定方法一般可分為氨基酸分析儀法［12］、離子色譜法［13］、高效液相色譜法［14］等，由于γ-氨基丁酸和瓜氨酸無法用氨基酸分析儀測定，并且由于氨基酸無紫外吸收，需要衍生后方能進行檢測，劉文等［15］采用柱前衍生反相高效液相色譜法測定了天花粉中γ-氨基丁酸和瓜氨酸的含量。但是該方法操作繁瑣，衍生化試劑不穩定，重復性較差。同時由于γ-氨基丁酸和瓜氨酸極性很強，普通C18色譜柱上沒有色譜保留，因此，本文采用RRLC-MS／MS法檢測栝樓桂枝顆粒中2種主要氨基酸含量，質譜測定無需衍生化，可以通過MRM定量離子對對其準確檢測。并且為了提高氨基酸的色譜保留，采用了極性C18色譜柱，兩種氨基酸在該色譜柱上，兩個成分達到基線分離，同時采用RRLC，與高效液相色譜法比較，大大縮短了分析的時間，節省流動相，且分析靈敏度高。

綜上，本文建立的RRLC-MS／MS法測定栝樓桂枝顆粒中γ-氨基丁酸與瓜氨酸的含量，方法簡便、準確、穩定，重復性好，可以為栝樓桂枝顆粒質量控制提供依據。

表3 樣品中γ-氨基丁酸和瓜氨酸加樣回收率測試結果

表4 樣品中γ-氨基丁酸和瓜氨酸含量（n=3）

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R917

A

1000-338X（2015）04-0043-03

2015-06-02

福建中醫藥大學校管課題（X2014132-學科）；福建省“大學生創新創業訓練計劃”項目（201410393008）；2015年福建省科技廳引導性項目（2015Y0067）

陳阿虹（1991—），女，2014級碩士研究生，研究方向：天然藥物化學成分與活性研究。

徐偉（1975-），男，副教授。E-mail：xwfjtcm@sina.com