溫補腎陽法對腎陽虛肺纖維化大鼠肺內CTGF表達的影響

溫補腎陽法對腎陽虛肺纖維化大鼠肺內CTGF表達的影響

趙敏徐安莉周艷艷陳會敏黃陳偉

(湖北中醫藥大學基礎醫學院，湖北武漢430061)

摘要〔〕目的探討溫補腎陽法治療腎陽虛肺纖維化(PF)的作用及機制。方法60只雄性6周齡Wistar大鼠采用隨機數字表法分為正常組、模型組和干預組，采用一次性博來霉素A5氣管插管給藥加腺嘌呤連續灌胃28 d復制腎陽虛PF大鼠模型。正常組大鼠氣管插管給予生理鹽水加等滲生理鹽水灌胃作為對照，模型組大鼠造模后生理鹽水灌胃14 d，干預組大鼠造模后加味參附湯灌胃14 d，每組于實驗第42天處死大鼠，留24 h尿液檢測17-羥皮質類固醇(17-OH-CS)含量，同時，HE和MASSON染色觀察肺纖維化程度，免疫組化法和Western印跡測定大鼠肺內結締組織生長因子(CTGF)蛋白的表達，RT-PCR檢測肺組織CTGF mRNA的表達。結果與正常組比較，腎陽虛肺纖維化模型大鼠尿17-OH-CS明顯下降，模型大鼠肺組織內可見肺泡結構大量破壞，大量膠原沉積，干預組大鼠肺泡結構也基本消失，可見較多的膠原沉積，病理組織學表現明顯輕于模型組。與正常組比較，模型組肺組織CTGF在肺內的表達水平明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，干預組大鼠肺內CTGF的表達降低(P<0.05)。結論腎陽虛PF大鼠腎陽虛癥狀明顯，肺內纖維化表現明顯，造模成功，加味參附湯可以改善大鼠腎陽虛癥狀，可能通過抑制CTGF蛋白表達而緩解肺內膠原的進一步沉積減緩肺纖維化的發展。

關鍵詞〔〕腎陽虛；肺纖維化；溫補腎陽法；CTGF

中圖分類號〔〕R563.9〔

基金項目：國家自然科學基金(No.81202615)

The expression of CTGF in the lungs of rats with kidney yang deficiency of pulmonary fibrosis by warming and Tonifying Kidney Yang method

ZHAO Min,XU An-Li,ZHOU Yan-Yan,etal.

Hubei University of Chinese Medicine,Basic Medical College,Wuhan 430061,Hubei,China

Abstract【】ObjectiveTo observe the expression of CTGF in the lungs of rats with kidney yang deficiency of pulmonary fibrosis by warming and Tonifying Kidney Yang method. Methods60 6-week-old male Wistar rats were randomly divided into normal,model and intervention groups. The rats of normal and model groups were given saline irrigation stomach,the rats of intervention group were given modified Shenfu decoction for 14 d. The content of 17-hydroxyl cortex steroids(17-OHCS) of 24 h urine was measured,lung fiber was observed by HE and MASSON staining,the expressions of CTGF protein and mRNA in lung tissue were tested by Western blot and RT-PCR.ResultsCompared with that of control group,and the content of 17-OHCS in model group was lower,decreased alveolar structures of kidney-Yang deficiency model of pulmonary fibrosis rats were destroyed,a large number of collagen was deposited;alveolar structures in intervention group were also disappeared,more collagen was deposited,but the pathological histology changes were significantly lighter than those of model group. Compared with that of control group,the expression of CTGF in pulmonary tissue of model group was increased(P<0.05),and it was lower in intervention group than that in model group(P<0.05).ConclusionsModified Shenfu decoction could improve the symptoms of kidney yang deficiency rats,and inhibit the expression of CTGF,relief further deposition of collagen in lung, slow down the development of pulmonary fibrosis.

【Key words】Kidney-yang deficiency；Lung fibrosis；Warming and Tonifying Kidney Yang method;CTGF

第一作者：趙敏(1980-)，女，講師，博士在讀，主要從事五臟相關研究。

肺纖維化(PF)是多種肺系慢性疾病的共同結局，肺泡上皮細胞及內皮細胞損傷、成纖維細胞增殖、膠原過度沉積、肺泡結構遭破壞是其典型的病理學特點，研究顯示結締組織生長因子(CTGF)可以介導成纖維細胞增殖和細胞外基質(ECM)產生，在肺纖維化中起關鍵作用〔1,2〕?；颊叱霈F肺纖維化的臨床癥狀往往已是肺系疾病的慢性遷延期，“絡虛不榮，虛實夾雜”為慢性遷延期病機特點，中醫治療認為“大凡絡虛，通補最宜”，故通補兼施，寓通于補為肺纖維化慢性遷延期總的施治原則?！澳I為生氣之根，肺為生氣之主?！迸R床中醫治療特發性肺纖維化時，許多醫家都考慮到了腎主納氣、輔助呼吸的作用。本實驗擬采用溫補腎肺、活血化痰的加味參附湯對腎陽虛肺纖維化的模型大鼠進行干預，通過CTGF在肺內的表達，確定溫補腎陽在臨床中藥防治肺纖維化的作用效果及其可能機制。

1材料與方法

1.1動物健康Wistar大鼠60只，6周齡，體重(200±20)g，SPF級別，雌雄各半，由華中科技大學同濟醫學院實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK(鄂)2004-0007。實驗大鼠自由飲水和采食，室溫(25±1)℃，光照明暗各12 h，適應性喂養1 w后進行實驗。

1.2藥物及制備氫化可的松注射液(10 mg/2 ml)，由上?，F代哈森(商丘)藥業有限公司生產(批號：11072512，國藥準字H41021930)。腺嘌呤：(Amresco公司分裝產品，北京欣經科生物技術有限公司)，5 g由蒸餾水溶解為20 mg/ml的水溶液；加味參附湯：附子、人參、蛤蚧、地龍、水蛭、法半夏購于湖北省中醫院，常規煎煮制成2.0 g/ml的加味參附湯，避光4℃冰箱保存，2 w內有效；博來霉素A5(15 mg/支)為天津太河制藥有限公司(生產批號：060401)生產，臨用前將博來霉素A5溶于蒸餾水中，并于超聲波振蕩15 min以保證分散均勻，稀釋為5 mg/ml的混懸液，即配即用。

1.3主要試劑CTGF單克隆抗體(sc-365970)，Santa Cruz公司分裝，辣根酶標記羊抗鼠二抗,蛋白Marker：美國Amresco公司；免疫組化試劑盒：武漢博士德公司；RNAlater組織保護液公司,Trizol組織裂解液：美國Invitrigen公司；逆轉錄試劑盒：Promega公司，PCR試劑盒及熒光定量PCR試劑(SYBRGreen Premix ExTaqTM)：日本TOYOBO公司；PCR引物由上海生工生物工程技術有限公司合成。

1.4方法

1.4.1動物造模參照楊禮騰等〔3〕制作腎陽虛肺纖維化大鼠模型，大鼠稱重后經乙醚麻醉，氣管內插管一次性注入博來霉素A5(5 mg/kg)，從當天開始灌胃腺嘌呤(300 mg/kg體重)連續28 d，建立腎陽虛肺纖維化模型。

1.4.2動物分組和給藥方法Wistar大鼠適應性喂養1 w，隨機分為正常組、模型組、干預組，每組20只。正常組氣管內插管注入生理鹽水(1 ml/kg體重)，2 h后，生理鹽水(15 ml/kg體重)灌胃連續28 d，后生理鹽水(5 mg/kg)繼續灌胃1連續14 d后處死。模型組氣管內插管一次性注入博來霉素A5(1 ml/kg)，2 h后，每天腺嘌呤(15 ml/kg)灌胃,連續28 d，然后大鼠生理鹽水(5 mg/kg體重)灌胃，每天一次，連續14 d后處死。干預組氣管內插管一次性注入博來霉素A5(1 ml/kg)，2 h后，每天腺嘌呤(15 ml/kg)灌胃連續28 d，然后大鼠“加味參附湯”水煎劑(5 ml/kg)灌胃，每天一次，連續14 d后處死。

1.4.3標本采集及指標檢測

1.4.3.1尿17-羥皮質類固醇(17-OH-CS)的檢測實驗第42天,將大鼠依次置于相應標記的大鼠代謝籠內,為了增加尿量，于早8∶00到晚11∶00每間隔3 h灌胃生理鹽水2 ml，共6次。收集24 h尿液，滴加防腐劑0.1 ml/10 ml防腐，-20℃保存，高嶺土法進行17-羥皮質類固醇(17-OH-CS)的檢測。

1.4.3.2HE染色觀察大鼠肺組織病理組織結構頸動脈放血處死實驗大鼠，取肺組織投入10%中性甲醛磷酸鹽緩沖液固定，常規石蠟切片、HE染色觀察各組實驗大鼠肺組織顯微鏡下形態學特點，按照Szapiel等〔4〕提供的方法,對實驗大鼠肺泡炎及肺纖維化程度進行半定量分析。

1.4.3.3MASSON染色觀察各組大鼠肺組織纖維化程度肺組織石蠟切片進行脫蠟至水，依次自來水和蒸餾水洗，Mayer蘇木素溶液染核7～9 min，充分水洗,如過染可鹽酸酒精分化，用Masson 麗春紅酸性復紅液5～10 min，入冰醋酸水溶液中浸洗片刻，移入1%磷鉬酸水溶液分化3～5 min，不經水洗,直接移入亮綠水溶液中浸染5 min，入冰醋酸水溶液中浸洗，95%酒精、無水酒精、二甲苯透明、中性樹膠封固。結果判斷：綠色：膠原纖維；橘紅色：紅細胞；紅色：細胞質；深藍色：細胞核。

1.4.3.4免疫組化檢測CTGF在肺內的表達肺組織石蠟切片進行脫蠟至水，經3%過氧化氫室溫孵育、水洗，抗原熱修復，按試劑盒說明書行常規SP水平法染色，PBS代替一抗做陰性對照。胞質、胞核出現棕黃色顆粒為陽性表現，全自動數碼顯微鏡捕捉到圖像采集窗口的免疫組化彩色圖像，通過灰度直方圖來調節分割范圍和閾值，已分割好的圖像自動計算每個陽性細胞的平均灰度值〔5〕。

1.4.3.5Western印跡檢測CTGF含量肺組織加細胞裂解液經機械和超聲勻漿，4℃低溫，12 000 r/min離心10 min，離心半徑10 cm。BCA法測總蛋白質濃度。制備10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠，各樣品取50 μg總蛋白上樣電泳，分離蛋白并轉到硝酸纖維素濾膜上， 轉膜完畢后，用含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液室溫搖床封閉，加入一抗4℃過夜，TBST洗膜后加入HRP標記的二抗以結合一抗，室溫搖床孵育2 h，TBST洗膜，化學發光法檢測，膜與化學發光底物孵育，經X膠片曝光顯影。使用BandScan軟件分析膠片灰度值。

1.4.3.6RT-PCR檢測CTGF mRNA含量用勻漿器攪勻肺組織樣品，每50～100 mg組織加入1 ml Trizol，提取總RNA，按試劑盒說明將RNA逆轉錄成cDNA，然后進行PCR擴增。引物序列如下：CTGF上游引物：5′-CCAATGACAATACCTTCTGC-3′，下游引物：5′-GAAAGCTAAACTTGACAGG-3′,產物長度148 bp;β-actin上游引物：5′-GTATGACTCTACCCACGGCCAAG-3′，下游引物：5′-GATCTCGCTCCTGGAAGATG-3′,產物長度101 bp。反應完成后，軟件將自動進行數據分析，調整基線，計算Threshold cycle(Ct值)。采用2-△△CT法〔6〕分析基因的相對表達量。

1.5統計學處理應用SPSS19.0統計學分析軟件進行t檢驗及方差分析。

2結果

2.1實驗大鼠一般情況正常組大鼠一般狀態好取食活躍、體重增加、皮毛光滑、口唇紅潤；第28天模型組和干預組大鼠取食排便活動均減少、出現毛發無光澤、豎毛、精神萎靡、反應遲鈍、體溫下降、倦縮拱背、口唇蒼白、尾巴濕冷、大便稀軟；第42天模型組大鼠出現毛發脫落，嗜睡、體重進一步下降，而干預組大鼠活動較42 d略有恢復，取食較活躍、體重稍有增加。

2.2各組大鼠肺組織病理學變化對照組：大鼠肺組織結構清晰,氣管及支氣管黏膜上皮細胞排列尚規整，杯狀細胞增生，肺內各級小支氣管、細支氣管及其伴行的管壁及周圍有少許中性粒細胞及淋巴細胞浸潤，血管腔充血。肺泡間隔基本正常，肺泡上皮細胞結構完整，間質可見少量紅細胞浸潤，MASSON染色在肺間質內可見少量條索狀膠原纖維。模型組：大鼠肺組織結構破壞明顯,氣管及支氣管黏膜上皮細胞排列紊亂，杯狀細胞大量增生，肺內各級小支氣管、細支氣管及其伴行的管壁及周圍可見大量中性粒細胞及淋巴細胞浸潤，肺泡間隔明顯增寬，幾乎未見正常肺泡結構，肺泡明顯萎縮塌陷，MASSON染色可見大量寬帶狀及片狀膠原纖維，呈彌漫性肺纖維化改變。干預組：大鼠肺組織結構明顯破壞,氣管及支氣管黏膜上皮細胞增生明顯，肺內各級小支氣管、細支氣管及其伴行的管壁及周圍可見較多中性粒細胞及淋巴細胞浸潤，肺泡間隔稍增寬，部分肺泡腔消失,為大量膠原纖維、成纖維細胞、淋巴細胞所占據，MASSON染色可見部分肺間質為膠原纖維所填充。見圖1，圖2。

模型組在造模期間因氣管插管引起強烈刺激而死亡兩只，在后期因衰竭而死亡兩只，故最后為16只，干預組在造模期間因氣管插管引起強烈刺激而死亡兩只，故最后為18只，與模型組進行比較，干預組實驗大鼠肺泡炎程度和肺纖維化程度較輕(P<0.05)，見表1。

表1　各組大鼠肺泡炎與肺纖維化程度的形態學觀察 ± s)

與正常組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05；下表同

圖1　大鼠肺組織病理組織學檢查(HE，×40)

圖2　各組大鼠肺組織MASSON染色(×100)

2.3實驗大鼠尿17-OH-CS含量與對照組〔(13.604±2.521)mmol/L〕比較，模型組〔(5.324±2.412)mmol/L〕和干預組〔(11.927±0.848)mmol/L〕大鼠的尿17-OH-CS含量較正常組降低(P<0.05)，與模型組相比較，干預組大鼠尿17-OHCS含量明顯升高(P<0.05)。

2.4實驗大鼠免疫組化檢測CTGF在肺內的表達檢測結果與正常組比較，模型組大鼠平均灰度值顯著升高(P<0.05)，干預組大鼠平均灰度值顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，干預組大鼠平均灰度值顯著降低(P<0.05)，見表2。

表2　各組大鼠肺組織CTGF陽性細胞、CTGF蛋白的

2.5實驗大鼠Western印跡檢測肺內CTGF蛋白表達檢測結果正常組CTGF蛋白的灰度值最小，條帶最細，模型組CTGF蛋白灰度值最大，條帶最粗。與正常組比較，模型組大鼠平均灰度值顯著升高(P<0.05)，干預組大鼠平均灰度值顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，干預組大鼠平均灰度值顯著降低(P<0.05)，見表2。

2.6實驗大鼠肺內CTGF mRNA含量檢測結果與正常組比較，模型組和干預組大鼠肺內CTGF mRNA表達明顯增高(P<0.05)，與模型組比較，干預組中CTGF mRNA表達強度明顯降低(P<0.05)，見表2。

3討論

中醫經典文獻中沒有和肺纖維化相同的病名，學者們認為肺纖維化屬于中醫學“肺痿”范疇〔7〕，發病多與體質虛弱、飲食、勞倦、內傷等因素有關，又復感外邪，導致肺氣先傷，故有呼吸急促、氣短之狀；腎為肺之子，主納氣，為氣之根，肺病虛損，久則母病及子，造成腎氣虛弱，不能納氣歸元，導致氣浮于上，故發為喘促，動則尤甚。氣管灌注博來霉素是西醫研究肺纖維化的經典模型,為了符合中醫辨證論治的特點，并結合臨床常用的證型，我們選擇了腎陽虛肺纖維化模型。

研究表明，在正常肺組織中，細胞外基質(ECM)是一種高度動態的基質，它的合成與降解受到精確地調節，許多細胞因子及通路參與了肺內基質合成和降解的過程，不過在慢性肺損傷過程中，ECM的合成遠遠超過其降解，結果就是逐步形成鐵絲網格纖維隔膜，以及膠原蛋白之間的化學交聯，最終形成肺纖維化。Pan等〔2〕觀察到在肺纖維化患者肺組織中可見CTGF表達在增生的Ⅱ型肺泡上皮細胞和活化的成纖維細胞這兩種細胞中，而且患者CTGF蛋白和mRNA表達明顯上調，提示肺纖維化的組織細胞可以通過產生CTGF，直接刺激纖維生成，導致肺組織內ECM增生，肺泡結果破壞，肺實質細胞被瘢痕組織取代，最終造成肺纖維化。CTGF可作為抗纖維化治療很有吸引力的靶基因，生理條件下表達水平很低，其作用范圍也主要局限于結締組織，CTGF具有較強的絲裂原活性，能刺激成纖維細胞的活化、增殖，能促進多種ECM成分如蛋白多糖、糖蛋白膠原Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ以及纖維連接蛋白、層黏蛋白的產生；抑制ECM的降解，能夠介導成纖維細胞的黏附，促進成纖維細胞向纖維連接蛋白黏附的作用〔8〕。CTGF高表達可以使血管平滑肌細胞的生長率、遷移率顯著增加，還可以促進胚胎發育、損傷修復及移植，促進新生血管的生成等。劉濤等〔9〕研究發現苦參堿及地塞米松可能是通過抑制TGF-β1和CTGF的表達來減少Ⅰ型膠原及Ⅲ型膠原的生成,從而減緩肺纖維化的形成。劉朝陽等〔10〕研究發現CTGF單鏈抗體可明顯減輕纖維化程度,有可能成為治療肺纖維化一種新的藥物。以上研究表明CTGF蛋白通過促進ECM的生成而加速肺纖維化的發生和發展。

《類證治裁·肺癰肺萎葉》指出：“肺萎傷在無形之氣，氣傷則調其元?！狈卫w維化的干預上應以扶正固本為主，以益氣補肺益腎為法，佐以活瘀?；谇捌谘芯匡@示〔11〕該腎陽虛肺纖維化模型是成功的，加味參附湯可以明顯抑制肺內細胞的凋亡，因此本次實驗在成功復制腎陽虛肺纖維化模型后，以益氣溫陽的參附湯為主方，進行加減組成由附子、人參、蛤蚧、地龍、水蛭、法半夏組成的“加味參附湯”對實驗大鼠進行干預，發現加味參附湯干預的實驗大鼠肺內CTGF表達明顯低于模型組，因此我們推測加味參附湯除了抑制肺內細胞的凋亡，其抑制肺泡上皮細胞和活化的成纖維細胞中CTGF的表達、改善肺內膠原的沉積，也可能是該方減緩肺纖維化發生的又一機制，這為溫補腎陽法的臨床應用提供了一定的實驗依據。

4參考文獻

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〔2013-06-15修回〕

(編輯李相軍)