小鼠腦缺血/再灌注損傷皮質區超氧化物歧化酶、丙二醛、活性氧表達與細胞凋亡的關系及姜黃素的干預作用

小鼠腦缺血/再灌注損傷皮質區超氧化物歧化酶、丙二醛、活性氧表達與細胞凋亡的關系及姜黃素的干預作用

李焰劉鳳麗1程冉冉1王芳1周燕1

(河北工程大學附屬醫院，河北邯鄲056002)

摘要〔〕目的探討姜黃素對小鼠皮質區缺血再灌注損傷后細胞凋亡的影響及與超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、活性氧(ROS)表達的關系。方法采用線栓法阻塞小鼠大腦中動脈(MCAO)，建立小鼠局灶性腦缺血/再灌注實驗模型，90只昆明小鼠被隨機分為假手術組(S組)、缺血/再灌注組(I組)和姜黃素(缺血前30 min腹腔給予10、20、40 mg/kg)組(C1、C2和C3組)，每組18只。各組于缺血2 h分為再灌24、48、72 h等三個亞組。在預定時間點觀察小鼠神經功能缺失的評分；TTC 染色測定腦梗死體積；TUNEL法檢測細胞凋亡變化。測定各組小鼠血漿中SOD活性，MDA、ROS含量。結果24 h神經功能評分及腦梗死體積I組明顯高于S組，C1、C2、C3組神經學評分及腦梗死體積低于I組(P<0.05)。SOD活力I組與S組相比較明顯下降。C1、C2、C3組與I組相比SOD活力升高(P<0.05)。ROS、MDA含量I組與S組相比較明顯上升，C1、C2、C3組與I組相比ROS、MDA含量明顯下降(P<0.05)。結論姜黃素對腦缺血再灌注氧自由基損傷具有保護作用，其抗氧化作用機制可能與調節相關凋亡基因表達減輕細胞凋亡有關。

關鍵詞〔〕姜黃素；腦缺血再灌注；氧自由基損傷；凋亡

中圖分類號〔〕R285〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：邯鄲市科技局課題(No.1123108080-17；1223108086-15)

1河北工程大學

第一作者：李焰(1973-)，男，主治醫師，主要從事腦血管疾病治療和機制研究。

腦缺血再灌損傷與氧自由基的大量產生有密切關系。腦缺血再灌后氧自由基迅速增加，腦組織和血清中脂質過氧化水平升高，氧自由基清除劑在腦缺血再灌時具有腦保護作用。姜黃素來源于姜科姜黃屬植物姜黃的干燥根莖，具有抗氧化、抗炎、抗感染、抗腫瘤的作用，近來研究也表明，姜黃素在抗細胞凋亡中也起著不容小覷的作用〔1〕。也有學者指出姜黃素對心肌〔2〕、腦〔3〕、腸〔4〕等臟器的缺血再灌注損傷有保護作用，但姜黃素對于小鼠腦缺血再灌損傷的保護作用，具體機制不詳。本文通過觀察姜黃素對小鼠自由基損傷指標的前后表達變化，結合皮質區細胞凋亡的檢測，進一步探討姜黃素抗缺血/再灌注損傷的保護作用機制。

1材料與方法

1.1動物及分組90只健康雄性昆明小鼠，清潔級，體重28～32 g，由河北工程大學醫學院實驗動物中心提供。術前在22℃～25℃實驗室中飼養1～2 d以適應實驗室環境。動物隨機分為：假手術組(S組)、缺血再灌注組(I組)、姜黃素低、中、高劑量組(C1、C2、C3組)，治療組于腦缺血前1 h腹腔給予10、20、40 mg/kg姜黃素。每組缺血2 h再灌后分為24、48、72 h等三個亞組，每組小鼠6只，分別用于神經功能學評分、TTC檢測及自由基指標和原位缺口末端標記法(TUNEL)檢測。

1.2主要試劑姜黃素購自美國Sigma公司，用二甲基亞砜溶解配置10 mg/ml儲存液，避光于4℃冰箱保存；活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒購自南京建成生物工程研究所。TUNEL試劑盒購自Santa Cruz生物公司。

1.3動物模型的制備根據Longa等〔5〕法及國內現有報道制作本模型，顯微手術斷開頸外動脈后插入遠端涂有硅膠約為0.1 mm的日本進口魚線，深度為距頸總動脈分叉處(1±0.1)cm，縫合皮膚，造成小鼠MCAO模型。90 min后，拉魚線至頸外動脈殘端，假手術組除插線0.1 cm外，其余步驟同模型組。

1.4腦梗死灶的測定再灌注24 h后，小鼠斷頭取腦，續冠狀切成2 mm厚的腦片，于2% TTC 中染色30 min，4%多聚甲醛固定2 h以上。計算機圖像處理系統測量每一腦切片尾側面的梗死面積，將各腦切片的梗死面積乘以2 mm (腦片厚度)再相加，既為梗死灶體積。

1.5神經功能檢測評分動物麻醉清醒后，參照Longa等〔5〕5分法進行神經功能評價。0分：無神經損傷體征；1分：不能完全伸展對側前爪；2分：向對側轉圈；3分：向對側傾斜；4分：不能自發行走意識喪失。

1.6TUNEL檢測細胞凋亡切片常規脫蠟至水，滴加蛋白酶K，濕盒中37℃孵育30 min，滴加 TUNEL混合溶液，50 μl/片，濕盒中37℃孵育60 min，滴加轉化劑 AP，50 μl/片，濕盒中37℃孵育30 min，DAB顯色，脫水，透明，封片。以不含末端脫氧核苷酸轉移酶的液體代替TUNEL 混合液作陰性對照。陽性率的定量分析：每個標本取4張切片，每張切片在海馬隨機選取4個視野，在200倍光鏡下應用目鏡網格測試系統，計數陽性細胞。

1.7生化指標測定再灌注后各相應時間點，處死小鼠，迅速取腦稱重。用生理鹽水制成10%腦組織勻漿液，低溫離心，取上清液，按試劑盒說明書分別測定大腦組織中SOD、ROS、MDA含量。按考馬斯亮藍法標定蛋白含量。

2結果

2.1神經功能行為評分缺血后各組動物均出現神經功能損害癥狀，神經功能缺損評分均高于S組(P<0.05)。與I組比較，C組神經功能缺損評分有所下降(P<0.05)，見表1。

2.2TTC染色結果缺血后缺血側鼠腦腫脹，有明顯的梗死灶形成，TTC染色正常腦組織呈紅色，缺血灶呈蒼白色。應用姜黃素后可見明顯縮小的梗死灶(P<0.05)，見表1。

表1　各組大鼠再灌注24 h后梗死體積比例及神經功能

與S組比較：1)P<0.05；與I組比較：2)P<0.05；下表同

2.3腦組織勻漿MDA含量Ⅰ組與C組含量與S組比較均明顯升高(P<0.05)；C組和Ⅰ組比較，C組相同時點MDA含量明顯下降(P<0.05)，見表2。

2.4腦組織勻漿ROS含量I組與C組含量與S組比較均明顯升高(P<0.05)；C組和I組比較，C組相同時點ROS含量明顯下降(P<0.05)，見表3。

2.5腦組織勻漿SOD含量I組與C組含量與S組比較均明顯降低(P<0.05)；C組和I組比較，C組相同時點SOD含量明顯升高(P<0.05)，見表4。

表2　各時間點腦組織勻漿MDA含量

表3　各時間點腦組織勻漿ROS含量比較

表4　各時間點腦組織勻漿SOD含量比較

2.6細胞凋亡檢測結果I組與S組比較，傷后24 h TUNEL陽性細胞開始顯著增加(P<0.05)，隨著時間推移陽性細胞表達逐漸增多，傷后48 h達高峰(P<0.05)。C組TUNEL陽性細胞各時相表達與模型組相似，但TUNEL陽性細胞數明顯減少，各時相點差異有統計學意義(P<0.05)。見表5，圖1。

表5　各組腦組織凋亡細胞比較

圖1　各組再灌注48 h腦組織凋亡細胞(TUNEL，×200)

3討論

缺血性腦血管疾病具有發病率高、死亡率高、致殘率高及復發率高的特點，嚴重危害了人類的健康和生命。由于大腦中動脈是臨床缺血性腦血管病的易患部位，因而大腦中動脈阻塞模型(MCAO)是目前常用的腦缺血動物模型。本研究復制的小鼠MCAO模型具有典型的神經功能缺損表現，TTC染色可見明顯的梗死灶，說明本實驗采用的動物模型符合實驗要求。同時預先給予姜黃素后，小鼠的神經功能學評分明顯改善，腦梗死體積明顯縮小，說明其對腦缺血再灌注損傷有一定的保護作用，與既往研究一致〔3〕。

本研究結果表明，腦缺血再灌注時體內氧化系統被激活，抗氧化系統受抑制，氧自由基大量生成而清除減少，體內氧自由基水平急劇升高，從而引發一定程度的脂質過氧化反應。姜黃素是中藥姜黃的主要成分，其副作用小，有重要的經濟價值和廣泛的藥理作用，現代醫學研究顯示〔3，6，7〕，姜黃素具有抗癌、抗炎、抗氧化、抗病毒、抗HIV-1整合酶等作用。而本實驗結果說明姜黃素可減少和抑制實驗小鼠腦內自由基的生成，具有抗氧化作用〔2〕。

腦缺血再灌注后存在神經細胞凋亡，如何減少或抑制缺血再灌后神經細胞凋亡、改善神經功能障礙一直是神經科學的研究熱點。在本實驗中，發現姜黃素各組可以顯著減少各時間點神經元凋亡，說明其對凋亡通路起了負調控作用。同時研究發現，細胞凋亡的高峰出現在48 h，與SOD活性的高峰，MDA、ROS含量高峰期相比較，出現的較晚，推測其可能通過調控某些信號通路而抑制了細胞凋亡〔8〕。胞內信號轉導通路十分復雜，因此還需對姜黃素抗缺血缺氧性神經元凋亡作更為深入的研究。以進一步明確姜黃素在腦缺血再灌注損傷中的作用。

4參考文獻

1張文華，周璐，徐淑軍.Caspase-3激活和細胞色素c釋放在腦缺血再灌注損傷中的作用〔J〕.山東大學學報(醫學版)，2007；45(12)：1193-6.

2伍陳海.姜黃素對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用〔J〕.重慶醫學，2011；40(1)：25-9.

3Lei J R，Qin J，Zhang J，etal.Effects of curcumin on inflammatory reaction and blood-brain barrier permeability in rats following cerebral ischemic injury〔J〕.Chin Pharmacol Bull，2010；26(1)：120-3.

4褚薇薇，聶蕾，和新盈，等.細胞色素c在后處理抗大鼠腸缺血-再灌注損傷細胞凋亡中的變化〔J〕.生理學報，2010；62(2)：143-8.

5Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats 〔J〕.Stroke，1989；20(1)：84-91.

6Thiyagarajan M，Sharma SS.Neuroprotective effect of curcumin in middle cerebral artery occlusion induced focal cerebral ischemia in rats〔J〕.Life Sci，2004；74(8)：969-85.

7Hsuuw YD，Chang CK，Chan WH，etal.Curcumin prevents methylglyoxal induced oxidative stress and apoptosis in mouse embryonia stem cells and blastocysts〔J〕.J Cell Physiol，2005，205(3)：379-86.

8紀風濤，曹銘輝，梁建軍.姜黃素預處理對大鼠腦缺血/再灌注損傷后AQP-4及腦水腫的影響〔J〕.中國藥理學通報，2011；27(4)：524-7.

〔2013-06-17修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)