辛伐他汀對慢性阻塞性肺病大鼠血漿及肺泡灌洗液中5－羥色胺表達的影響

辛伐他汀對慢性阻塞性肺病大鼠血漿及肺泡灌洗液中5-羥色胺表達的影響

王雅杰姜雪張立海王麗紅袁林棟孫武裝

(河北醫科大學第一醫院呼吸內科，河北石家莊050031)

摘要〔〕目的觀察5-羥色胺(HT)在吸煙誘導的慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠血漿及肺泡灌洗液中的表達，探討5-HT在COPD發病中的作用及辛伐他汀對其影響。方法①采用煙熏法建立COPD大鼠模型。將30只大鼠隨機分為三組：對照組、煙霧暴露組、辛伐他汀組各10只。自煙霧暴露之日起辛伐他汀組給予辛伐他汀(5 mg/kg)，于煙霧暴露前灌胃，每日一次。16 w后，測量體重、肺動脈壓(PAP)、肺功能，并對肺組織病理形態學進行觀察。②采用酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測5-HT在COPD大鼠血漿及肺泡灌洗液中的含量，觀察辛伐他汀對其表達的影響。結果①三組實驗前體重無明顯差異(P>0.05)。實驗結束時，煙霧暴露組體重較對照組明顯下降(P<0.01)；辛伐他汀組體重較煙霧暴露組升高(P<0.05)。②與對照組比較，煙霧暴露組平均內襯間隔(MLI)明顯增加(P<0.01)，平均肺泡數(MAN)明顯降低(P<0.01)；辛伐他汀治療后 MLI降低(P<0.05)，MAN增加(P<0.01)。③相對于對照組，煙霧暴露組動態肺順應性(Cdy)、用力呼氣容積(FEV)0.3/用力呼氣量(FVC)明顯下降(P<0.05)，呼氣相氣道相應阻力(Re)、吸氣相氣道相應阻力(Ri)升高(P<0.05)；辛伐他汀組治療后Re、Ri、FEV0.3/FVC、Cdy相對于煙霧暴露組均有改善(P<0.05)。與對照組比較，煙霧暴露組和辛伐他汀組mPAP明顯升高(P<0.05)。辛伐他汀治療后mPAP明顯降低(P<0.05)。④三組右心和左心室、室間隔重量比〔RV/(LV+S)〕值差異有統計學意義(P<0.05)。與對照組比較，煙霧暴露組RV/(LV+S)增大(P<0.05)；辛伐他汀組治療后RV/(LV+S)降低(P<0.05)。⑤與對照組比較，煙霧暴露組及辛伐他汀組血漿及肺組織中5-HT較對照組明顯升高(P<0.05)。肺泡灌洗液中5-HT水平無明顯變化(P>0.05)。辛伐他汀組治療后血漿及肺組織中5-HT降低(P<0.05)，肺泡灌洗液中5-HT水平無明顯變化(P>0.05)。⑥5-HT 在血漿中及肺組織中的表達與右心室肥厚指數(RVHI)呈正相關(r=0.702，0.543，P=0.000，0.002)，與mPAP呈正相關(r=0.772，0.821，P=0.000)。結論①大鼠香煙煙霧暴露16 w建立COPD模型成功。②5-HT在COPD發生、發展過程中有明顯的變化及聯系，在COPD發生發展中起重要作用。辛伐他汀可能是治療COPD有效的方法之一。

關鍵詞〔〕慢性阻塞性肺病；吸煙；5-HT；辛伐他汀

中圖分類號〔〕R563.3〔

通訊作者：孫武裝(1966-)，男，主任醫師，博士，主要從事呼吸系統疾病研究。

第一作者：王雅杰(1980-)，女，主治醫師，主要從事慢性阻塞性肺病研究。

世界銀行/世界衛生組織的資料表明，至2020年慢性阻塞性肺疾病(COPD)將位居世界疾病經濟負擔的第五位，到2020年COPD將位居全球死亡原因的第三位〔1〕。目前一致認為其主要病理改變為氣道、肺實質和肺血管的慢性炎癥，發展到晚期可出現肺動脈高壓(PAH)、肺源性心臟病等并發癥。研究發現5-羥色胺(HT)與呼吸系統疾病有密切關系(如阻塞性睡眠呼吸暫停〔2〕、支氣管哮喘〔3〕、PAH〔4〕等)。血液中5-HT主要儲存于血小板中，當受到炎癥反應、低氧等因素刺激時，血小板大量釋放5-HT，從而引起一系列的病理生理反應。有學者認為，5-HT與肺血管平滑肌上多種受體結合可引起肺血管收縮〔6〕及肺血管平滑肌細胞(PASMC)增殖〔7〕。他汀類藥物即三羥基三甲基戊二酰輔酶A(HMG-CA)。還原酶抑制劑通過降低血脂，減少降低心血管事件發生的防治效果，已經得到證實。近年來，人們越來越關注他汀類藥物的非降脂作用：主要包括抑制平滑肌細胞的增殖、黏附和遷移，改善血管內皮功能，抗炎抗氧化，免疫調節，抗血栓形成，穩定動脈硬化粥樣斑塊及可能的抗心律失常，抗腫瘤，抗骨質疏松等。本研究擬揭示在COPD病理狀態下5-HT水平變化及辛伐他汀對其的影響。

1材料與方法

1.1動物分組與模型建立采用宋一平等〔8〕煙熏方法制作大鼠COPD PAH模型，雄性健康SD大鼠30只，體重(100±10)g，6周齡，河北醫科大學實驗動物中心提供，平均隨機分為3組：對照組、煙霧暴露組、辛伐他汀組各10只。各組平均體重差異無統計學意義。采用被動煙熏法建立COPD PAH大鼠模型：煙霧暴露組及辛伐他汀組每日在熏煙箱內給予煙霧干預，每次吸煙20支(鉆石牌香煙)，每次吸煙1 h，2次/d，日間兩次吸煙間隔4～5 h，共16 w，并同時給予辛伐他汀組(5 mg/kg)灌胃干預，1次/d。

1.2肺功能測定飼養16 w后，測量大鼠體重，用1%苯巴比妥(50 mg/kg)經腹腔內注射麻醉，切開氣管、插入氣管插管(為一靜脈針去針頭的塑料軟管)，將大鼠放入動物肺功能儀中(北京蘭博科技有限公司)，接壓力傳感器，設置基本吸呼比及氣道壓力，進行肺功能測試。監測大鼠8個自主呼吸周期，記錄肺氣道壓力，肺容積的變化，計算出呼氣相氣道相應阻力(Re)、吸氣相氣道相應阻力(Ri)。通過三通管向肺內輸注6 ml空氣使大鼠被動深呼吸，隨即測定用力呼氣量(FVC)和用力呼氣容積(FEV)0.3，并計算FEV0.3/FVC。

1.3支氣管肺泡灌洗液(BALF)及外周血、肺標本的采集解剖暴露心肺，將3 ml生理鹽水經氣管插管緩慢注入左肺，停留20 s后再回抽，反復3次(回收率70%～80%)，將BALF注入無菌離心管內，混勻。剪取右肺前三個肺葉，放入液氮中儲存；剪取右肺剩余的一個肺葉放入裝有甲醛的廣口瓶中(待以后病理形態學檢查用)。

1.4HE染色中性甲醛固定后脫水、石蠟包埋常規病理學切片HE染色，電鏡下觀察肺組織病理形態學變化，應用日本Olympus顯微鏡，BHEC顯微鏡彩色圖像處理系統觀察肺組織病理形態并測量：①平均內襯間隔(MLI)：在顯微鏡視野中央劃一十字交叉線，計算交叉線相交的所有肺泡隔數(NS)，然后計算十字線總長度(L)，MLI=L/NS。該指標反映肺泡平均內徑的大小。②平均肺泡數(MAN)：精確計數每個視野中的肺泡數(Na)，并計算出每個視野的面積(S)，MAN=Na/S，算出每個視野的每mm2平均肺泡數，該指標反映肺泡密度大小。

1.55-HT的測定采用酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測5-HT的含量，具體按照廠家說明書進行。第一單抗為美國Abnova公司，5-HT檢測靈敏度為5 ng/ml，檢測批內誤差均<10%，批間誤差<15%。酶標儀產自美國BIO-TEK型號：ELx800。

1.6測量平均肺動脈壓(mPAP)和左右心室比值參照孫波等〔9〕的方法。所有大鼠分離右頸外靜脈，經右頸外靜脈行右心插管，進行 mPAP 測定，導管另一端經壓力換能器與多道生理記錄儀(四川成都儀器廠)連接并記錄mPAP。處死大鼠后，完整取出心臟，濾紙吸水后分別稱重，測右室(RV)游離壁及左室和室間隔(LV+S)的質量，計算右心和左心室、室間隔重量比(RVHI)=RV/(LV+S)比值，以此作為判斷大鼠右室肥大的指標，并以此作為間接反映肺動脈壓力的指標。

1.7統計學方法采用SPSS17.0統計軟件進行單因素方差分析，t檢驗，Logistic回歸分析。

2結果

2.1大鼠體重實驗前3組體重無顯著差異(P>0.05)。實驗結束后，煙霧暴露組及辛伐他汀組體重較對照組明顯下降(P<0.01)；辛伐他汀組治療后體重較煙霧暴露組明顯增加(P<0.05)。見表1。

2.2大鼠肺組織病理學變化對照組大體肺組織標本光滑、紅潤、平整、有彈性。顯微鏡下觀察氣管壁及肺泡清晰，無炎性細胞浸潤。氣道上皮的纖毛規整，肺泡間隔正常，未見肺大皰。與對照組比較，煙霧暴露組大體肺組織標本體積增大，外表粗糙，顏色蒼白，彈性差。鏡下觀察氣管壁較對照組增厚、管腔變窄，氣道上皮的纖毛排列紊亂、局部纖毛脫落。小血管及細支氣管壁周圍均有大量炎性細胞浸潤；肺泡壁變薄，形成肺大皰。辛伐他汀組肺臟較煙霧暴露組肺組織稍有縮小。肺泡壁稍變薄，肺泡腔略減小，仍有肺氣腫改變，但較煙霧暴露組局限，氣管壁及小血管周圍炎性細胞浸潤減少，主要以局限性肺氣腫樣改變為主，纖毛排列紊亂及脫落現象較煙霧暴露組減輕。見圖1。與對照組比較，煙霧暴露組MLI 明顯增加(P<0.01)，MAN明顯降低(P<0.01)；與煙霧暴露組比較，辛伐他汀組 MLI降低(P<0.05)，MAN增加(P<0.01)。見表2。

表1　煙霧暴露前后3組體重的變化

與對照組比較：1)P<0.01；與煙霧暴露組比較：2)P<0.05；表2、4同

圖1　各組肺組織病理HE染色(×400)

分組MLI(μm)MAN(個/mm2)對照組41.274±2.737381.051±35.756煙霧暴露組97.803±6.9941)170.606±29.5991)辛伐他汀組90.701±6.8411)2)201.373±30.4331)2)F/P值275.617/0.000125.810/0.000

2.3mPAP和RVHI與對照組比較，煙霧暴露組和辛伐他汀組mPAP明顯升高(P<0.01)。與煙霧暴露組比較，辛伐他汀組mPAP明顯降低(P<0.01)。與對照組比較，煙霧暴露組RVHI顯著增大(P<0.01)；與煙霧暴露組比較，辛伐他汀組RVHI顯著降低(P<0.01)。見表3。

表3　3組mPAP、RVHI比較 ± s， n=10)

與對照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與煙霧暴露組比較：3)P<0.01

2.4肺功能與對照組比較，煙霧暴露組動態肺順應性(Cdy)、FEV0.3/FVC顯著下降(均P<0.01)，Re、Ri顯著升高(均P<0.01)；而與煙霧暴露組比較，辛伐他汀組Re、FEV0.3/FVC、Cdy均有改善(均P<0.05)，Re、Ri有所下降(均P<0.05)。見表4。

表4　3組肺功能比較

2.55-HT的測定結果與對照組比較，煙霧暴露組及辛伐他汀組血漿及肺組織中5-HT明顯升高(P<0.01)。BALF 5-HT水平無明顯變化(P>0.05)。與煙霧暴露組比較，辛伐他汀組血漿及肺組織中5-HT明顯降低(P<0.01)，BALF 5-HT水平無明顯變化(P>0.05)。見表5。

2.6相關性分析5-HT 在血漿中及肺組織中的表達與RVHI呈正相關(r=0.702，0.543；P=0.000，0.002)，與mPAP呈正相關(r=0.772，0.821；P均=0.000)。

表5　3組血漿及肺組織中5-HT的表達

與對照組比較：1)P<0.01；與煙霧暴露組比較：2)P<0.01

3討論

COPD的發生、發展與肺臟對有害氣體或顆粒的異常炎癥有關〔10〕，而導致COPD發生的最重要危險性因素是煙草〔11，12〕。香煙煙霧中尼古丁、氧自由基、焦油等有害物質對肺臟產生的局部炎癥反應及大量的氧自由基對肺部產生氧化應激反應，兩者相互影響、相互促進，在COPD發病中共同發揮著重要作用。激活的炎癥細胞釋放多種炎癥細胞因子，如白三烯、腫瘤壞死因子(TNF)-α白細胞介素(IL)等，引起氣道及肺實質反復損傷，從而導致肺泡壁、氣道壁的結構破壞和重塑〔13〕。隨著病程發展，損傷和修復過程循環發生，逐漸出現肺血管重構、PAH產生及肺心病形成。

辛伐他汀通過競爭性抑制HMG-CoA還原酶，阻斷膽固醇生成，對心血管保護作用超出單純降脂作用，這與其抗增殖、抗炎性作用和改善內皮細胞功能密切相關〔14～18〕。Lee等〔19〕采用煙熏(10支/d，連續16 w)誘導的大鼠肺氣腫、PAH模型，辛伐他汀干預組(5 mg·kg-1·d-1)明顯抑制煙熏誘導的肺動脈壓力增高，減輕煙熏引起的肺小動脈肌型化，對肺血管周圍炎癥細胞浸潤有明顯抑制作用。近年數項研究報道他汀類藥物可改善PAH大鼠肺血流動力學和肺血管重構改變〔20～25〕。本研究驗證了上述理論。

5-HT是體內一個重要的絲裂素，它能促進肺血管平滑肌增生，肺動脈血管收縮和局部微血栓形成〔26〕。本文說明在COPD PAH大鼠模型中，5-HT高表達與肺動脈壓力升高是相關的。他汀類藥物對COPD PAH大鼠具有治療作用。COPD PAH大鼠模型中，5-HT能夠促進右心室肥厚。他汀類藥物對右心室幾何構型的改變也有一定的保護作用。野百合堿注射的大鼠模型中，他汀類藥物能明顯改善大鼠血流動力學參數及抑制5-HT的表達，推測他汀類藥物對野百合堿誘導的大鼠PAH的治療作用與其抑制5-HT的表達可能有關〔27，28〕，此結論與本研究結果有相似之處。

綜上，COPD大鼠肺組織及血漿中5-HT高表達促進肺血管重構，而辛伐他汀通過緩解肺血管重構來降低肺動脈壓力，而辛伐他汀是否能用于臨床，還需要基礎實驗研究。

4參考文獻

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〔2013-12-17修回〕

(編輯苑云杰)