聯合水蛭注射液后處理對腦缺血損傷大鼠磷酸化內皮型一氧化氮合酶表達的影響

聯合水蛭注射液后處理對腦缺血損傷大鼠磷酸化內皮型一氧化氮合酶表達的影響

胡躍強唐農1吳林1孫淑榮梁妮易燦輝1

(廣西中醫藥大學第一附屬醫院神經內科，廣西南寧530023)

摘要〔〕目的觀察缺血后處理(IPOC)聯合水蛭注射液后處理對腦缺血損傷大鼠磷酸化內皮型一氧化氮合酶(p-eNOS) mRNA及其蛋白表達的影響。方法SD大鼠40只，隨機分為假手術組(SO組)、缺血再灌注對照組(MCAO組)、IPOC組、IPOC+水蛭注射液后處理組(P-L組)四組。采用線栓法制備大鼠大腦中動脈缺血(MCAO)模型及IPOC模型，應用實時熒光定量PCR和Western印跡技術檢測p-eNOS mRNA及其蛋白表達變化。結果SO組有少量p-eNOS mRNA及其蛋白表達；MCAO組大鼠腦缺血再灌注24 h缺血半暗帶p-eNOS表達較SO組明顯增高(P<0.05)；IPOC組二者的表達水平較MCAO組明顯升高(P<0.05,P<0.01)；P-L組能較IPOC組進一步升高其表達(P<0.05,P<0.01)。結論腦IPOC可能通過誘導p-eNOS的表達發揮其神經保護作用，水蛭注射液后處理可進一步促進其表達而發揮神經保護作用。

關鍵詞〔〕缺血后處理；水蛭注射液；磷酸化內皮型一氧化氮合酶

中圖分類號〔〕R285〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：廣西自然科學基金(2012GXNSFAA053075);廣西衛生廳重點課題(重2012046)

通訊作者：唐農(1962-)，男，博士，教授，博士生導師，主要從事缺血性腦血管病研究。

1廣西中醫藥大學

第一作者：胡躍強(1973-)，男，博士，教授，碩士生導師，主要從事缺血性腦血管病研究。

缺血后處理(IPOC)是近年發現的重要內源性腦保護機制，因其能減輕腦缺血/再灌注(I/R)損傷而引起廣泛關注〔1〕，并已成功地應用于臨床〔2〕。最近研究發現，蛋白激酶B/內皮型一氧化氮合酶(Akt/eNOS)信號途徑參與了I/R損傷，發揮神經保護效應〔3〕。相對于IPOC手段，藥物后處理簡便易行，因此更具有應用前景。水蛭注射液經臨床研究證實對腦卒中先兆和腦梗死急性期有確切治療作用的中藥制劑〔4,5〕，但其后處理效應及療效機制有待于進一步闡明。本實驗通過比較IPOC和聯合水蛭注射液后處理對I/R損傷后Akt/eNOS轉導信號通路的關鍵蛋白eNOS磷酸化(p-eNOS)水平的影響，以探討二者的神經保護機制。

1材料和方法

1.1 動物分組及處理健康雄性SD大鼠40只，體質量(250±50)g，隨機將大鼠分為4組：假手術組(SO組)、缺血再灌注對照組(MCAO組)、IPOC組、IPOC+水蛭注射液后處理組(P-L組)。分別作如下處理：SO組：僅實施假手術但不進行腦缺血操作，同時腹腔注射生理鹽水4 ml；MCAO組：實施90 min的腦缺血和24 h的再灌注，在再灌注即刻腹腔注射生理鹽水4 ml；IPOC組：在再灌注即刻自CCA內抽出線栓30 s，然后將線栓重新置入30 s，反復進行此操作3次后進行再灌注24 h，并在再灌注即刻腹腔注射生理鹽水4 ml；P-L組：在IPOC組操作的基礎上，在再灌注即刻，腹腔注射水蛭注射液4 mg/kg。

1.2 造模方式參照Longa的線栓法建立大鼠MCAO動物模型。分離并結扎大鼠左頸外動脈遠端和頸總動脈近端，將前端用火焰燒圓的尼龍線從頸總動脈殘端插入，進線約18~20 mm，大腦中動脈缺血(MCAO)后90 min抽出線栓，完成腦缺血。然后參照文獻〔6〕行缺血后處理，即在再灌注即刻自CCA內抽出尼龍線栓30 s，然后將線栓重新置入30 s，反復進行此操作3次后進行再灌注24 h。

1.3 藥物制備水蛭選用菲牛蛭，又稱廣西菲牛蛭。采用稀醇滲漉提取，再經跨熱處理法制得水蛭注射液，每支2 ml，每毫升含生藥1 g，由本院制劑室制備。

1.4 主要試劑兔抗大鼠p-eNOS (Ser1177)多克隆抗體(Santa Cruz)，耦聯有辣根過氧化物(HRP)羊抗兔IgG二抗(博士德公司)，內參GAPDH(康成生物公司)，總RNA提取試劑盒(TIANGEN公司)，PCR反應試劑盒及逆轉錄試劑盒(TaKaRa公司)，引物及內參均由大連寶生物有限公司提供。

1.5 缺血半暗帶腦皮質p-eNOS mRNA表達測定①大腦組織總RNA提取：參考Trizol試劑盒說明書提取總mRNA；②引物合成：熒光定量RT-PCR所用p-eNOS和GAPDH引物序列如下：p-eNOS正義：5′- GGGCCAGGGTGATGAGCTCTG-3′；反義：5′-CCCTCCTGGCTTCCAGTGTCC -3′；產物長度為324 bp；GAPDH正義5′-GTGCTGAGTATGTCGTGGAGTCT-3′；反義5′-GTGGAAGAATGGGAGTT GCTGT-3′，產物長度610 bp；③比較兩基因擴增效率：選取cDNA樣品模板進行5倍梯度稀釋，p-eNOS與GAPDH分別進行real-time PCR反應，得出熒光曲線，通過cDNA濃度梯度的log值對ΔCT值作圖比較兩基因擴增效率；④反應體系及條件：兩種基因同管擴增，反應體系均為10 μl，其中SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×) 5 μl ，cDNA模板1.0 μl、兩種基因上下游引物(10 pmol/μl)各0.4 μl、探針(10 pmol/μl)各0.4 μl，加無RNA酶的水至3.2 μl。在DNA Engine OpticonTM2 連續熒光檢測系統(MJ Research公司)中進行擴增反應，反應條件為：94℃預變性30 s，95℃ 5 s，58.2℃ 20 s，62.0℃ 20 s，35個循環，4℃保存。每例樣品及陰性對照均設4個平行復孔，取均值。

1.6 缺血半暗帶腦皮質內p-eNOS蛋白表達測定缺血側頂葉大腦皮質約100 mg，冰上研磨組織后加預冷的蛋白裂解液，繼續碾磨至液態，然后4℃，14 000 r/min 離心15 min，提取上清液，取20 μl用 BCA法進行蛋白定量測定，所剩上清液配一致蛋白濃度，并按4∶1的比例加上樣，各樣本提取等量總蛋白(60 μg)，經100℃ 5 min變性后，采用10%SDS-PAGE進行垂直電泳進行分離，電泳后將凝膠上的蛋白條帶電轉移至PVDF膜上進行免疫反應。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h ，然后依次加入兔抗p-eNOS抗體，37℃孵育2 h，4℃過夜；耦聯有辣根過氧化物(HRP)羊抗兔IgG 室溫孵育2 h。Beyo ECL Plus超敏發光液中X-感光盒內曝光。以上反應均在塑料袋內進行，其間用TBST充分洗滌。將膠片進行掃描或拍照，采用Alpha Ease FC軟件進行圖像分析，獲取各組Western印跡條帶的平均光密度(OD)值，內參為GAPDH，目的蛋白與內參光密度比值即為目的蛋白的相對值。

1.7 統計學方法采用SPSS11.0行單因素方差分析及LDS-t檢驗。

2結果

2.1 p-eNOS mRNA表達變化SO組有少量p-eNOS mRNA表達；MCAO組大鼠腦缺血再灌注24 h缺血半暗帶p-eNOS mRNA表達較SO組明顯增高(P<0.05)；IPOC組其表達水平較MCAO組明顯升高(P<0.01)；P-L組能較IPOC組進一步升高其表達(P<0.05)。見表1。

2.2 p-eNOS蛋白表達的變化SO組有少量蛋白表達(0.814±0.057)；MCAO組缺血半暗帶p-eNOS蛋白表達較SO組明顯增高(1.066±0.065,P<0.05)；IPOC組其表達水平較MCAO組明顯升高(1.248±0.083，P<0.05)；P-L組能較IPOC組進一步升高其表達(1.512±0.133，P<0.01，圖1)。

表1　各組p-eNOS mRNA相對量的表達變化

與SO組比較：1)P<0.05；與MCAO組比較：2)P<0.01；與IPOC組比較：3)P<0.05

圖1　各組大鼠p-eNOS蛋白的表達

3討論

IPOC是指長時間缺血后，于再灌注前短時間內進行反復短暫的再灌和停灌，可明顯減輕缺血組織和器官的再灌注損傷。最近研究顯示Akt/eNOS通路在I/R損傷的保護機制中發揮著重要的作用〔3,7〕，該通路是細胞內重要的腦保護防御機制之一，上調此信號通路可對抗多種凋亡基因的表達，發揮細胞保護作用。但該通路是否參與了IPOC的保護機制鮮見報道。eNOS是Akt的重要下游底物之一，也是一種絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，活化的Akt與eNOS結合后，誘導eNOS向細胞膜轉位，磷酸化其N端的Ser活性位點而使eNOS失活，從而阻滯其對下游蛋白的磷酸化阻止凋亡發生，發揮神經保護作用。

藥物后處理是指在長時間缺血后,于再灌注前或再灌注開始的幾分鐘內用藥,通過藥物干預來減輕器官的再灌注損傷。其保護作用機制與IPOC相似,但藥物后處理更具有臨床應用價值,為器官再灌注損傷的治療提供了新策略。目前已證實，藥理學刺激亦能通過外源性機制誘發后處理現象，即能夠進一步增強IPOC的器官保護作用〔8,9〕。但是，目前的藥物后處理主要是局限在吸入麻醉藥物，如異氟烷和七氟烷等，即所謂的“麻醉藥物后處理”〔10〕。而中藥以其療效明顯、副作用小、多靶點的作用途徑而成為IPOC研究的熱點。水蛭是廣西的優勢中藥品種，我院自上世紀90年代開始對水蛭進行臨床藥理學研究，在國內率先對其劑型進行改良制成水蛭注射液，經臨床及動物實驗證實它對腦缺血損傷具有良好的治療作用〔4,5,11,12〕。但聯合水蛭注射液后處理尚未涉及神經保護領域，是一個嶄新的研究方向。本結果提示聯合2種后處理方式有協同作用效果。

4參考文獻

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12梁健芬,董少龍,胡躍強,等.水蛭注射液對大鼠腦缺血再灌注TNF-α、IL-1β和ICAM-1蛋白表達的影響〔J〕.陜西中醫雜志,2006;35(12):1605-7.

〔2013-12-08修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)