胃癌組織中TGFβ1,Smad3,Smad7與ki-67 mRNA表達及其相關性

胃癌組織中TGFβ1，Smad3，Smad7與ki-67 mRNA表達及其相關性

張德利馬艷周姝1

(承德醫學院附屬醫院麻醉科，河北承德067000)

摘要〔〕目的探討轉化生長因子(TGF)β1、Smad3、Smad7與ki-67 mRNA在胃癌中的表達及其相關性。方法選擇經病理證實為胃癌組織的標本60例，正常胃組織標本20例，采用RT-PCR技術檢測TGFβ1 mRNA、Smad3 mRNA、Smad7 mRNA與ki-67 mRNA的表達水平。結果在胃癌組織中，TGFβ1、Smad7與ki-67 mRNA水平明顯高于正常胃組織(P<0.05)，Smad3 mRNA水平明顯低于正常胃組織(P<0.05)。低分化胃癌組織中TGFβ1、Smad7與ki-67 mRNA水平明顯高于高中分化胃癌組織(P<0.05)，Smad3 mRNA水平明顯低于高中分化胃癌組織(P<0.05)。TGFβ1、Smad7與ki-67 mRNA三者在胃癌中的表達呈正相關，Smad3 mRNA與TGFβ1、Smad7、ki-67 mRNA呈負相關。結論正常胃組織和胃癌組織中TGFβ1、Smad3、Smad7與ki-67 mRNA的表達有差異，其與胃癌的發生、發展及分化程度密切相關。

關鍵詞〔〕胃癌；TGFβ1；Smad3；Smad7；ki-67

中圖分類號〔〕R735.2〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：承德市科學技術研究與發展計劃項目(20132036)

通訊作者：周姝(1979-)，女，碩士，主治醫師，主要從事胃癌的基礎與臨床研究。

1吉林省腫瘤醫院麻醉科

第一作者：張德利(1979-)，男，碩士，主治醫師，主要從事胃癌的基礎與臨床研究。

轉化生長因子(TGF)β/Smads信號通路中的任意環節出現異常都可能導致信號轉導紊亂，從而導致胃癌的發生與發展〔1,2〕，Smad3和Smad7是TGFβ/Smads信號傳導通路中的組件。在基礎狀態下Smad7大部分位于細胞核中，而ki-67僅在增殖細胞核中表達，是較為理想的檢測細胞增殖活性的抗體。目前關于TGFβ1、Smad3、Smad7與ki-67 mRNA在胃癌中的研究尚未見報道，本研究擬通過在基因水平研究其相互關系，為研究胃癌的發病機制及藥物治療的潛在靶點提供理論依據。

1材料與方法

1.1研究對象收集我院2011年12月至2012年9月手術治療后經病理證實的胃癌組織標本60例和正常胃組織20例(距離腫瘤10 cm以上認為是正常胃組織)。60例胃癌患者中，男38例，女22例，年齡43～77歲，平均(54.8±9.7)歲；低分化者32例，高中分化者28例。

1.2RT-PCR所用試劑AMV第一鏈cDNA合成試劑盒(SK1040)(上海生工生物工程技術服務有限公司)，引物合成(上海生工生物工程技術服務有限公司)，50 bp DNA Ladder(北京天根生化有限公司MD108)，相關引物序列，TGFβ1正義：5′-GGCCAGATCCTGTCCAAGC-3′，反義：5′-GTGGGTTTCCACCATTAGCAC-3′；Smad3正義：5′-CCATCTCCTACTACGAGCTGAA-3′，反義:5′-CACTGCTGCATTCCTGTTGAC-3′；Smad7正義:5′-TTCCTCCGCTGAAACAGGG-3′，反義:5′-CCTCCCAGTATGCCACCAC-3′；ki-67正義:5′-ACGCCTGGTTACTATCAAAAGG-3′，反義:5′-CAGACCCATTTACTTGTGTTGGA-3′；β-actin正義:5'-CATGTACGT TGCTATCCAGGC-3′；反義:5'-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′。

1.3方法

大部分Smad7在基礎狀態下位于細胞核中，接受TGF-β刺激后轉移至細胞質中，通過與Smad3競爭TGF-βRI而阻斷TGF-β的信號傳導，形成所謂的自分泌反饋抑制通路，調節正性和負性Smads。本實驗證明Smad3的表達缺失，TGFβ1、Smad7蛋白的異常表達共同參與了胃癌的發生。

1.3.2瓊脂糖凝膠電泳結果分析采用Image pro plus 7.0軟件統計各條帶的積分光密度值。

2.2TGFβ1、Smad3、Smad7與ki-67 mRNA的相關性分析TGFβ1、Smad7與ki-67 mRNA在胃癌中的表達呈正相關(r=0.51,0.67,均P<0.01)，Smad3 mRNA與TGFβ1、Smad7、ki-67 mRNA呈負相關(r=-0.47,-0.42,-0.39,P<0.01)。

2結果

8Fitchev PP，Weislak SM，Lee C，etal.Thrombospondin-1 regulates the normal prostate in vivo through angiogenesis and TGF-beta activation〔J〕.Lab Invest，2010；90(7)：1078-90.

辜鴻銘先生在評價民國時的英語教育時曾說過“今人讀英文十年，開目僅能閱報，伸紙僅能修函，皆由幼年讀一貓一狗式之教科書，是以終其身只有小成。”筆者在大學從事公共英語教學已有21年時間，回顧這21年的教學歷程，筆者不得不感嘆：在辜先生眼中的“小成”儼然是當今大部分大學生難以達到的“巔峰”。別說是“閱報”“修函”，僅一篇英文自我介紹就讓許多人撓頭不已。英語學習經歷是相當一部分國人學習生涯之“痛”。

TGFβ1調控的基因通常依賴于TGFβ1活化的Smad2或Smad3，Smad3的激活主要發生在活化的細胞。大多數調控TGFβ轉錄的反應由Smad3、Smad4介導。Smad3通過結合靶基因啟動子區的Smad3/Smad4 DNA結合序列，直接啟動靶基因的轉錄。TGFβ介導的生長抑制由Smad3介導，Smad3調節c-myc，p21Cipl的表達及Rb磷酸化狀態〔5〕。Han等〔6〕研究發現，缺乏Smad3的胃癌細胞不受TGF-β的生長抑制作用，當重新導入Smad3后又表現出生長抑制。亦有研究發現Smad3基因敲除的小鼠具有抵抗化學物質誘導皮膚癌形成的功能〔7〕。研究結果顯示，Smad7也可通過抑制Smad3的活化、Smad3/Smad4異源復合物的形成及核轉位，拮抗TGFβ對細胞的生長抑制效應。在腫瘤的發生、發展過程中TGF-β1與Smad7的表達是互相調節，共同發揮作用的。有研究發現〔8〕，TGF-β作用較長時間(2 d)后，可直接導致興奮性信號分子Smad3的基因表達水平下降，抑制性信號分子Smad7的基因表達水平顯著上升，而使胞內TGF-β信號轉導功能下調，細胞對TGF-β的反應減弱。此外，在體外正常皮膚成纖維細胞中，TGF-β可使Smad7的表達快速而短暫地被誘導，這就提示Smad7是TGF-β早期即刻基因作用的靶點，起到了自身負反饋調節的作用。同時，這說明TGF-β不僅可刺激Smads信號通路功能的活化，其對內源性Smads的表達也起到了潛在的調節作用。近來的報道顯示，Smad7基因的擴增與胃癌，結腸癌患者的預后不良有著密切的關系。表明TGF-β信號轉導抑制因子Smad7過表達是腫瘤細胞抵抗TGF-β的生長抑制作用的機制之一〔9，10〕。

1.4統計學處理采用SPSS11.5軟件進行t檢驗和直線相關分析。

在本研究中，我們發現大于4mg/ml濃度的槐耳清膏作用 NCI-N87 24h 后，Beclin-1、LC3-II、PTEN在mRNA水平及蛋白水平均明顯升高，結果具有統計學意義，且與濃度呈現正相關性。從上述結果我們推測，槐耳清膏可能影響自噬基因Beclin-1表達，同時增加PTEN表達，導致自噬發生，較高濃度的槐耳清膏效果明顯，但超過32mg/ml是否自噬效應增加尚沒有試驗結果證明。

臨床病理特征TGFβ1/β-actinSmad3/β-actinSmad7/β-actinki-67/β-actin正常胃組織0.21±0.020.59±0.070.08±0.010.12±0.01高中分化胃癌組織0.57±0.061)2)0.33±0.031)0.17±0.021)0.53±0.061)低分化胃癌組織0.89±0.091)2)0.09±0.011)2)0.42±0.051)2)0.82±0.101)2)

與正常胃組織比較:1)P<0.01;與高中分化胃癌組織比較:2)P<0.01

M.100 bp DNA Marker；1.正常胃組織 2.高中分化胃癌組織；3.低分化胃癌組織 圖1　TGFβ1、Smad3、Smad7與ki-67在各組織中的表達

3討論

Smad蛋白家族是TGFβ信號傳遞途徑中的中轉分子〔3〕。Smad3、Smad7均為Smads家族的主要成員，是TGFβ信號傳導途徑中必需的下游分子，其性質的改變可與多種惡性腫瘤的生物學行為有關。Smad3作為腫瘤抑制基因在TGFβ信號轉導途徑中發揮重要作用；Smad7的異常表達可以拮抗TGFβ通路，從而使其不能有效監督腫瘤細胞的過度增生，從而引發腫瘤〔4〕。

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1.3.1實驗方法提取RNA按說明書嚴格進行，采用Trizol提取總RNA，目的基因與內參的PCR反應條件均為94℃預變性2 min，94 ℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環32次，取20 μl擴增產物及6 μl的DNA Ladder過1.5%瓊脂糖凝膠電泳，采用ZF型紫外透射反射分析儀攝片。

TGFβ1在許多細胞中具有廣泛的作用，本實驗結果表明，胃癌組織中TGFβ1的表達與ki-67有正相關性。隨著胃癌臨床分期的進展，淋巴結轉移的出現，TGFβ1和ki-67的表達均增強，說明TGFβ1的表達越強，胃癌細胞的增殖能力越強。最近的研究顯示，Smad7可以不依賴TGF-β而獨立發揮其生物學功能〔11，12〕，因此本研究結論的有關機制還需要更加深入的探討。

4參考文獻

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3Singh P，Wig JD，Srinivasan R.The Smad family and its role in pancreatic cancer〔J〕.Indian J Cancer，2011；48(3)：351-60.

4Dowdy SC，Mariani A，Reinholz MM，etal.Over expression of the TGF-beta antagonist Smad7 in endometrial cancer〔J〕.Gynecol Oncol，2005；96(2)：368-73.

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9Kim YH，Lee HS，Lee HJ，etal.Prognitic significance of the expression of smad4 and smad7 in human gastric carcinoma〔J〕.Ann Oncol，2008；15(4)：574-80.

7Li AG，Lu SL，Zhang MX，etal.Smad3 knockout mice exhibit a resistance to skin chemical carcinogenesis〔J〕.Cancer Res，2004；64(21)：7836-45.

2.1RT-PCR檢測結果在胃癌組織中，TGFβ1、Smad7與ki-67 mRNA的表達明顯高于對照組(P<0.05)，Smad3 mRNA的表達明顯低于對照組(P<0.05)。TGFβ1、Smad3、Smad7與ki-67 mRNA的表達與胃癌的分化程度、有無淋巴結轉移有關。見表1、圖1。

6Han SU，Kim HT，Seong Do，etal.Loss of Smad3 expression increases susceptibility to tumorigenicity in human gastric cancer〔J〕.Oncogene，2004；23：1333-41.

結果表明，試件壁厚從4 mm到12 mm的極限承載力顯著提高，分別為157 kN、163 kN、167 kN和183 kN，當壁厚大于8 mm時，柱子極限承載力提高幅度開始增大；而小于8 mm時，承載力提高幅度基本不大。加大鋼管厚度，承載力逐漸提高但提高幅度有限。壁厚4 mm、6 mm的極限承載力比壁厚8 mm、10 mm、12 mm的極限承載力更早達到。

科學評審小組負責對報送美國國立衛生研究院的大部分（約75%）課題申請書進行初審。其根據學科和研究領域建立的100多個科學評審小組是該評審系統的核心，各科學評審小組主要由各研究領域或醫學專業著名的非政府科學家組成，成員一般有16～20人，名單一般在網絡公開，由相應的科學評審管理官員（Scientific Review Administrator，SRA）負責管理。初審分網評和會評兩步。

4)在機車C4、C5修程時對主斷路器的各插座及聯鎖觸頭系統各部件表面清潔，不許有裂損、變形；更新主斷路器7-8，9-10，11-12輔助聯鎖。

10Jiang X，Castelao JE，Vandenberg D，etal.Genetic variations in SMAD7 are associated with colorectal cancer risk in the colon cancer family registry〔J〕.PLoS One，2013；8(4)；604-14.

40年來，全省自然資源系統廣大干部職工堅決貫徹黨的理論和路線方針政策，按照省委、省政府部署要求，牢記職責使命，勇立時代潮頭，圍繞中心、服務大局，拼搏進取、砥礪前行，取得了一個又一個輝煌成就，譜寫了自然資源事業改革發展的壯麗篇章。

11Hong S，Lee C，Kim SJ.Smad7 sensitizes tumor necrosis factor induced apoptosis through the inhibition of antiapoptotic gene expression by suppressing activation of the nuclear factor-kapp-aB pathway〔J〕.Cancer Res，2007；21(67)：9577-631.

12Kimura ET，Matsuo SE，Ricarte-Filho JC.TGF beta，activin and SMAD signalling in thyroid cancer〔J〕.Arq Bras Endocrinol Metabol，2007；14(51)：683-9.

〔2015-03-17修回〕

(編輯滕欣航)