缺血后處理對再灌注損傷后炎癥因子的調(diào)節(jié)作用

缺血后處理對再灌注損傷后炎癥因子的調(diào)節(jié)作用

陳艷1高丹姜云鵬張蕾2

(吉林大學基礎醫(yī)學院病理生物學教育部重點實驗室,吉林長春130021)

摘要〔〕目的探討缺血后處理(POC)調(diào)節(jié)腎缺血再灌注損傷(RIPI)后炎癥因子的表達水平及其對大鼠腎臟保護作用的機制。方法成年SD大鼠隨機分成：假手術組(Sham組)、缺血再灌注組(I/R組)、POC組。Sham組為對照組。I/R組: 采用無創(chuàng)動脈夾夾閉左腎動脈45 min，切除右腎，然后去除血管夾，恢復血流灌流。POC組:在I/R組的基礎上再進行3個循環(huán)的30 s缺血/30 s再灌注的手術干預(共計3 min)，最后打開血管夾使血液再灌注。將各組動物于清潔條件下飼養(yǎng)，于第2天及1個月時收集各組動物血清，檢測腎臟功能。第2天時，蘇木素-伊紅(HE)染色觀察腎臟組織結構。RT-PCR法檢測各組中腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-6和IL-10的表達水平。結果再灌注第2天，Sham組血清肌酐(Cr)和血尿酸氮(BUN)的濃度維持在正常水平，而I/R組Cr和BUN的濃度明顯增高(P<0.01)，POC組Cr和BUN的濃度顯著低于I/R組(P<0.05)。再灌注1個月，三組中Cr的濃度無明顯差異(P>0.05)。HE染色結果顯示，再灌注第2天，Sham組中腎組織形態(tài)正常，I/R組腎小管上皮細胞變性，部分脫落，管腔內(nèi)可見管型，POC組腎組織病變較輕。RT-PCR法檢測結果顯示，再灌注第2天，Sham組TNF-α、IL-6和IL-10的表達水平很低，I/R組中TNF-α、IL-6的表達水平明顯升高，POC組低于I/R組，而IL-10的表達水平明顯高于I/R組。結論POC降低了缺血再灌注后的急性炎癥反應，從而對大鼠的腎臟起到了保護作用。

關鍵詞〔〕缺血再灌注損傷；缺血后處理；炎癥因子

中圖分類號〔〕R6〔

通訊作者：張蕾(1974-)，女，博士，副主任醫(yī)師，主要從事缺血再灌注損傷機制研究。

1吉林大學附屬吉林醫(yī)院 吉林市中心醫(yī)院病理科

2吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院

第一作者：陳艷(1988-)，女，碩士,主要從事腎缺血再灌注損傷機制研究。

腎臟缺血再灌注損傷(RIPI)廣泛發(fā)生于腎移植、腎部分切除術、腎動脈血管成形術、腎積水、泌尿外科手術、心肺分流術、主動脈搭橋手術、膿毒癥和肝移植等情況下〔1,2〕。腎缺血再灌注后會引發(fā)急性炎癥反應，包括巨噬細胞和中性粒細胞的浸潤和激活，促炎性細胞因子和趨化因子的釋放以及黏附分子表達的增強〔3〕。研究表明，急性炎癥反應在引起腎臟損害的過程中扮演一個關鍵性的角色〔4,5〕。缺血后處理(POC)即缺血后持續(xù)再灌注前，通過給予多次短暫的再灌注/缺血(I/R)處理可減輕再灌注損傷。但POC的具體保護機制還不明確。本文通過研究POC對大鼠腎臟RIPI后炎癥因子的調(diào)節(jié)作用，從而闡明其對腎臟的保護作用，為其臨床應用奠定理論基礎。

1材料與方法

1.1材料、試劑及儀器清結級雄性SD大鼠，體重180～220 g，由吉林大學實驗動物中心提供。無創(chuàng)動脈夾，手術鑷，手術剪，眼科剪，眼科鑷，止血鉗，持針器，醫(yī)用紗布，醫(yī)用手術縫合線，醫(yī)用棉簽，一次性注射器(1 ml,5 ml)，無菌EP管，大鼠飼養(yǎng)籠、墊料及鼠糧等。

戊巴比妥鈉(Sigma,USA)，TRIzol?Reagent(Invitrogen,USA)，RNLater(北京泰天和生物技術有限公司)，TaKaRa逆轉錄試劑盒〔寶生物工程(大連)有限公司〕，無水乙醇(北京化工廠)，0.9%氯化鈉注射液(四川科倫藥業(yè)股份有限公司)，10%中性甲醛緩沖液，伊紅染液，蘇木精染液等。

半自動輪轉式石蠟切片機(Leica RM2245,Germany)，微量臺式低溫離心機(Thermo Scientific,USA)，PCR儀(Thermo Scientific,USA)，KD-BMⅡ生物組織包埋機(浙江金華科迪儀器設備有限公司)，分析天平(沈陽龍騰電子稱量儀器有限公司)，凝膠成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)等。

1.2方法

1.2.1動物模型的制備將清潔級雄性成年SD大鼠隨機分為，假手術組(Sham組)，缺血再灌注組I/R組及POC組每組8只。應用50 mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉SD大鼠后，將其腹部朝上，四肢固定于手術板上。大鼠腹部皮膚經(jīng)過75%乙醇消毒后，用手術剪刀剪開腹部，暴露其腹腔臟器，然后用棉簽輕輕將其撥開，找到大鼠左側腎臟，剝離腎蒂被膜，分離出左腎動脈。Sham組大鼠：暴露出左腎但不進行任何處理。I/R組大鼠：用無創(chuàng)動脈夾夾閉左腎動脈45 min，切除右腎，然后去除血管夾，恢復血流灌注。POC組大鼠：用無創(chuàng)動脈夾夾閉左腎動脈45 min，切除右腎，然后去除無創(chuàng)動脈夾，之后進行3個循環(huán)的30 s缺血/30 s再灌注的手術干預(共計3 min)，最后打開血管夾恢復血流灌注。各組手術完成后，分別縫合關閉腹腔。將其于清潔級條件下飼養(yǎng)，補充水及飼料。

1.2.2標本的采集將各組動物模型，于清潔級條件下飼養(yǎng)2 d。采用50 mg/kg戊巴比妥鈉將大鼠麻醉使其腹部朝上并于手術板上固定，用剪刀沿腹中線打開腹腔，使用一次性注射器抽取其腹靜脈血液于已標記好的EP管中，并將其放置冰上暫存。然后找到左腎，用鑷子剝離左腎被膜，剪斷腎蒂，取出腎臟，立即置于冰上的培養(yǎng)皿中暫存。輕輕擠出腎臟中的血液，應用紗布將其吸干，然后將腎臟縱向切開，取一小塊放于10%中性甲醛緩沖液中保存，其余部分組織切碎并分成幾份置于已加入RNlater的EP管中，于-20℃冰箱中保存。

1.2.3 腎臟功能學的檢測將以上收集的各組動物血液放于4℃離心機中，4 000 r/min，離心10 min。使用加樣器分別收集EP管中上層血清成分，注意在吸取的過程中切勿觸到下層血細胞。然后分別檢測各組動物血清肌酐(Cr)和血尿素氮(BUN)的含量。

1.2.4蘇木素-伊紅(HE)染色觀察腎臟組織結構將10%中性甲醛緩沖液中的組織固定48 h后，對其進行脫水、透明及包埋。使用石蠟切片機對于已包埋好的組織塊進行切片，其厚度為5 μm，并于干燥箱中烘干。將各組石蠟切片進行常規(guī)的HE染色，并在顯微鏡下觀察各組切片并進行圖像的采集。

1.2.5RT-PCR法檢測各組中的腫瘤壞死因子(TNF)-α，白細胞介素(IL)-6，IL-10表達水平將保存于RNLater中的腎組織，取出少量，加入一定量的Trizol裂解液，裂解提取總RNA。按照TaKaRa逆轉錄試劑盒說明書來逆轉錄合成相應的cDNA，以cDNA 作為模板，分別加入TNF-α、IL-6、IL-10、β-actin引物及其他反應液，然后分別進行反應得到PCR產(chǎn)物。TNF-α引物：正義:5’-GACCCTCACACTCAgATCAT-3′，反義：5′-TTGAAGAGAACCTGGGAGTA-3′；IL-6引物：正義：5′-TCCTACCCCAACTTCCAATGCTC-3′，反義：5′-TTGGATGGTCTTGGTCCTTAGCC-3′；IL-10引物：正義：5′-CACTGCTATGTTGCCTGCTC-3′，反義：5′-TGTCCAGCTGGTCCTTCTTT-3′；β-actin引物：正義：5′- TGTATGCCTCTGGTCGTACC-3′，反義: 5′-CAACGTCACACTTCATGATGG- 3′。采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察PCR產(chǎn)物，應用凝膠圖像分析系統(tǒng)進行各電泳帶灰度值的測定。

1.6統(tǒng)計學分析應用SPSS17.0軟件行t檢驗。

2結果

2.1血清Cr和血BUN的檢測結果在第2天，Sham組Cr〔(0.7±0.08)mg/dl〕和BUN〔(18.7±4.5)mg/dl〕的濃度維持在正常水平，而I/R組Cr〔(5.3±0.75)mg/dl〕和BUN〔(148.1±25.1)mg/dl〕的濃度明顯增高(P<0.01)，POC組Cr〔(1.9±0.35)mg/dl〕和BUN〔(49.2±9.1)mg/dl〕的濃度顯著低于I/R組(P<0.05)。在再灌注1個月，三組中Cr的濃度無明顯差異〔Sham組(0.75±0.04)mg/dl,POC組(1.35±0.08)mg/dl,I/R組(1.75±0.25)mg/dl〕(P>0.05)。I/R組中Cr和BUN的濃度與其他兩組差異不明顯，但仍有高于Sham組和POC組的趨勢〔Sham組BUN(18.7±2.6)mg/dl，POC組(46.1±5.3)mg/dl,I/R組(68.3±13.7)mg/dl〕。

2.2各組動物腎臟組織結構的改變再灌注2 d，Sham組中腎組織形態(tài)正常。I/R組中腎組織結構發(fā)生顯著病變，腎小管上皮細胞腫脹，壞死細胞脫落至管腔造成管腔狹窄，并且出現(xiàn)蛋白管型等。而POC組的腎組織病變較輕，其形態(tài)接近于Sham組。見圖1。

2.3各組動物TNF-α，IL-6，IL-10的表達水平再灌注2 d，Sham組TNF-α、IL-6、IL-10的表達很低，I/R組中TNF-α、IL-6的表達水平明顯升高，POC組TNF-α，IL-6的表達水平低于I/R組，而IL-10的表達水平明顯高于I/R組。見圖2。

圖1　腎臟組織學的檢測(×200)

圖2　TNF-α、IL-6、IL-10表達水平的檢測

3討論

RIPI是住院患者發(fā)病率和死亡率的一個重要原因〔6～9〕。RIPI主要歸因于大量的活性氧簇(ROS)的產(chǎn)生以及炎癥反應，導致的一系列的細胞凋亡和壞死的發(fā)生〔10,11〕。POC是一種有效的保護手段，其最早是由Zhao等〔12〕在犬心肌缺血模型中提出來的，該研究是在再灌注早期通過一系列交替的動脈再灌注和再閉塞的人工操作，其稱為后處理。已有報道〔13〕，POC在大腦、心臟、肝臟及腎臟等多種臟器中具有保護作用。

Cr和BUN作為臨床上檢測腎臟功能的主要指標，其值的升高意味著腎臟的功能受到了損害。本研究結果表明，在缺血再灌注早期，POC可以大幅度降低血清中Cr和BUN的含量，使其恢復正常水平，而且隨著時間的延長，I/R大鼠的腎功能逐漸代償。

TNF-α主要由活化的單核巨噬細胞產(chǎn)生，是炎癥反應的一個重要介質。IL-6主要是由淋巴細胞、單核巨噬細胞合成和分泌，也是炎癥反應的重要介質，具有多種生物化學活性。本研究說明POC可以有效降低促炎性細胞因子的產(chǎn)生。

IL-10由活化的巨噬細胞產(chǎn)生，作為一種重要的抗炎性細胞因子，能抑制促炎性細胞因子的產(chǎn)生。本研究說明POC可以促進抗炎性細胞因子的產(chǎn)生。

綜上所述，POC以降低缺血再灌注后的急性炎癥反應，從而對大鼠的腎臟起到了保護作用。

4參考文獻

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〔2013-09-12修回〕

(編輯袁左鳴)