針刺配合芹菜素治療對膠原誘導性關節炎小鼠Th1/Th2細胞亞群的影響

針刺配合芹菜素治療對膠原誘導性關節炎小鼠Th1/Th2細胞亞群的影響

張潔劉巍1朱新輝1周鳴鳴朱小波2

(南通大學醫學院，江蘇南通226019)

摘要〔〕目的觀察針刺配合芹菜素對膠原誘導性關節炎(CIA)小鼠的療效和外周血中Th細胞亞群分布，探討針刺配合芹菜素對類風濕關節炎(RA)的療效及其機制。方法在初次免疫后第4周開始對CIA小鼠連續針刺治療3 w，觀察其關節炎指數，應用ELISA技術對CIA組小鼠和對照組小鼠脾淋巴細胞中輔助T細胞(Th)亞群分布進行檢測。結果治療后與模型組相比，針刺組、芹菜素組及針刺加芹菜素組小鼠的關節炎指數下降(P<0.05)，針刺加芹菜素組下降更明顯(P<0.01)。針刺和芹菜素均能抑制CIA小鼠Th1細胞分泌，降低Th1/Th2 比值，對Th2 細胞的分泌無明顯影響。結論針刺配合芹菜素治療CIA小鼠療效明顯優于單獨針刺或芹菜素治療CIA小鼠的關節炎，可能是通過調節Th1/Th2，抑制Th1分化格局使之接近動態平衡而起作用的。

關鍵詞〔〕針刺；芹菜素；類風濕關節炎；輔助T細胞

中圖分類號〔〕R965.3〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：南通市社會發展科技計劃資助項目(S2012042，HS13921)；江蘇高校優勢學科建設工程資助項目(PAPD)

通訊作者：周鳴鳴(1977-)，男，博士，副教授，主要從事中醫學研究。

1南通大學附屬第二醫院關節外科2如皋市人民醫院兒科

第一作者：張潔(1980-)，男，博士，主要從事免疫學研究。

1材料與方法

1.1動物SPF級雄性DBA/1小鼠，8～12周齡，體重20～25 g，由南通大學實驗動物中心提供。所有小鼠均在室溫22℃相同條件下分籠飼養，用標準顆粒飼料自由喂養，自由飲水。

1.2藥品與試劑牛Ⅱ型膠原、弗氏完全佐劑(CFA)和不完全佐劑(IFA，Chondrex公司)，小鼠干擾素(IFN)-γ和白介素(IL)-4的ELISA試劑盒(依科賽公司)，AP(美國Sigma公司，A3145)；二甲基亞砜(DMSO,美國Sigma公司)。

1.3主要儀器臺式高速低溫離心機(XL100型，美國Beckman公司)、電熱恒溫培養箱(Heraeus，德國)、針灸針(華佗牌)、微量進樣器(上海安亭微量進樣器廠)和UV-3100PC型紫外可見分光光度計(上海美譜達儀器有限公司)。

1.4方法

1.4.1小鼠膠原性關節炎模型的建立Ⅱ型膠原100 μg溶于0.05 mol/ml醋酸50 μl中，濃度為2 mg/ml，將溶解的膠原與CFA等體積混合，冰浴中使用三通充分乳化。免疫動物時，在小鼠尾根部多點皮下注射0.1 ml乳劑。基礎免疫后第21天以同樣方法重復，避開初次免疫部位，進行加強免疫。再次免疫佐劑選擇用IFA。同時對照組用CFA與0.05 mol/ml冰醋酸等體積充分乳化后按上述方法進行免疫及IFA與0.05 mol/ml冰醋酸等體積乳化后21 d加強免疫。

1.4.2動物分組與處理50只小鼠分成5組(n=10):即針刺組、AP組、針刺+AP組,模型組和對照組。針刺組小鼠以自制布袋固定，選取雙側足三里(后三里)穴(膝關節下外側，腓骨小頭下3.5 mm處)，直刺3 mm，每天1次，連續3 w，共21次；AP組(AP溶于1% DMSO),CIA小鼠出現癥狀后(21 d)分別給予腹腔注射AP 10 mg·kg-1·d-1；針刺加AP組同時給予注射AP 10 mg·kg-1·d-1和雙側足三里(后三里)穴位刺激，連續3 w；對照組給予腹腔注射1% DMSO，連續3 w。

③河（溝）道水文地貌狀況改善效果。河道水文形態特征的修復是本項目的重點，也取得了顯著的成效。經調查和統計，6條小流域主溝道工程前后水文地貌特征有了整體改善，Ⅲ級、Ⅳ級溝段長度明顯減少，Ⅱ級溝段長度增加。2.53km的Ⅳ級溝段修復為Ⅲ級或Ⅱ級，使得Ⅳ級溝段長度比例由工程前的14.76%降為工程后的10.10%；3.73km的Ⅲ級溝段修復為Ⅱ級或Ⅰ級，使得Ⅲ級長度比例由工程前的31.51%降為24.69%；項目區Ⅱ級溝段長度明顯增加，增加總長為6.25km，所占比例由34.35%升至45.84%。同時，6條流域溝道的垃圾全部清理，挖砂采石段全部修復，對溝道生態質量和水質改善發揮了顯著作用。

1.4.3小鼠關節炎評分各關節病變程度按5級評分法。0：無紅腫；1：關節紅不腫；2：關節輕度紅腫；3：關節中度紅腫；4：關節重度紅腫伴功能障礙。關節炎分數為每只小鼠所有病變關節分數的總和，最高分為16分。

1.4.4血清的IFN-γ和IL-4檢測免疫4 w后，對所有實驗小鼠采用摘眼球法取血，0.5 ml/只，置于37℃水浴箱中1 h，然后置4℃冰箱中以析出血清，4 000 r/min離心10 min，吸取血清，貯于-80℃冰箱保存。ELISA試劑盒檢測IFN-γ和IL-4。

1.4.5大體指標觀察觀察小鼠的精神狀態，毛發的光澤亮度，毛發的疏密,實驗小鼠的體重和其他性狀。

1.5統計學方法應用SPSS15.0軟件進行t檢驗。

2結果

2.1針刺和AP影響CIA小鼠的大體觀察牛Ⅱ型膠原免疫的模型組小鼠，與對照組小鼠比較，初次免疫后3 w左右開始出現關節炎癥狀，即鼠爪明顯紅、腫，關節炎指數均明顯增加。21 d開始后足出現關節腫脹，然后蔓延到前足，并日漸加重，在45 d左右達高峰。另外，在發病過程中，動物的毛色失去光澤、輕微脫毛，體重減輕。而針刺和AP組發病推遲出現癥狀，整個病程足爪腫脹程度減小。毛色失去光澤、輕微脫毛，體重減輕這些癥狀也有一定的減輕。

2.2針刺和AP對于CIA小鼠關節炎癥狀的影響根據關節病變程度按5級評分法，與對照組小鼠比較，模型組小鼠21 d開始后足出現關節腫脹，并日漸加重，在45 d左右達高峰。針刺組、AP組和針刺+AP組的關節炎指數也輕于模型組(P<0.05)，提示針刺配合AP可以更好地改善RA臨床癥狀，保護關節，且療效優于單純針刺或AP治療。見圖1。

圖1　針刺和AP對CIA小鼠關節評分的影響(n=10)

2.3針刺和AP對小鼠血清IFN-γ、IL-4水平的影響IL-4水平在針刺+AP組與模型組相比升高明顯(P=0.03)，針刺組和AP組與模型組相比升高不明顯；IFN-γ水平在針刺+AP組和AP組均較模型組有顯著下降，只有針刺組與模型組相比下降不明顯。模型組IFN-γ/IL-4比對照組明顯升高(P=0.002)，而治療組與模型組相比均顯著下降，其中針刺+AP組下降最多(P=0.006)。見表1。

組別IFN-γ(pg/ml)IL-4(pg/ml)IFN-γ/IL-4模型組316.29±19.49135.41±4.072.34±0.11AP組284.77±5.312)142.73±4.212.00±0.101)針刺組303.81±3.64139.85±9.202.17±0.191)針刺+AP組248.33±8.602)143.69±9.831)1.73±0.182)對照組190.11±9.342)163.67±5.211.16±0.062)

與模型組比較：1)P<0.05；2)P<0.01

3討論

輔助性T細胞Th1與Th2細胞之間的動態平衡對維持機體正常的免疫功能起重要作用，Th1細胞功能亢進可促進某些器官特異性自身免疫病的發展〔4〕。近年研究提示RA發病與Th1細胞介導的自身免疫應答異常有關。Th1主要分泌IFN-γ、IL-2、IL-12和TNF-α，以IFN-γ為代表；Th2主要分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10，以IL-4為代表。RA患者關節滑膜、滑膜液和外周血中存在Th1/Th2亞群失衡。Kanik等〔5〕觀察到，同慢性患者相比，早期RA的外周血中，IL-2和IFN-γ明顯增多，隨著關節炎的發展，Th1細胞逐漸減少，Th2細胞占優勢，這可能與Th1細胞選擇性地聚集到關節炎癥部位有關。

CIA小鼠作為類似RA的動物模型,表現為多發性外周關節炎,關節局部紅腫,嚴重致關節畸形。病理變化為增生性滑膜炎,關節軟骨破壞、骨侵蝕,關節腔內有炎性細胞浸潤,這些病理表現及實驗室指標與人RA非常相似。另外，CIA小鼠的關節炎程度還可以通過指數量化評分評估這些特點決定CIA小鼠是篩選和研究治療RA藥物的較理想動物模型〔6〕。

祖國醫學常利用多種手段聯合治療疾病，針灸配合中藥往往能起到“事半功倍”的效果。針灸對RA有較好的療效，一般有效率可達85%～95%，尤其是早期RA患者〔7〕。周建霞等〔8〕用閃刺重灸法，先用毫針于阿是穴快速進針，疾進疾出，取雙足三里，百會予以補法，風池、豐隆予以瀉法，合谷、曲池、大椎予以平補平瀉法；后于閃刺點以溫和灸法總有效率93.8%。周燕媛〔9〕針刺治療15例，取主穴肝俞、膈俞、夾脊穴、腎俞血海、足三里；配穴合谷，委中，阿是穴，豐隆陽，陵泉，曲池，風池等；以電針連接阿是穴，夾脊，環跳，陽陵泉，懸鐘，足三里等穴；采用《最新國內外疾病診療標準》評價其療效，結果總有效率93.3%。結合上述研究的成果，選取了與RA發病位置較靠近的穴位(足三里)作為靶穴位。AP是存在于各種水果及蔬菜中的常見的黃酮類化合物，現有研究表明AP具有抗炎、抗氧化和抗癌等作用〔10～12〕。研究表明AP具有免疫抑制作用，能抑制T細胞過度增殖、活化，抑制Th1型細胞功能亢進及調節Th1/Th2平衡。此外，中藥單體AP來源廣泛，有安全、不良反應小等特點，治療RA具有潛在的臨床應用前景。基于以上原因，實驗中選取了AP配合針刺來治療CIA小鼠的關節炎病癥。

本研究發現，針藥配合使用對于CIA小鼠模型的關節炎癥有更好的治療效果，針刺(雙足三里)和AP均能抑制Th1細胞占優勢的格局，調節CIA小鼠的Th1/Th2平衡，阻止RA發生炎癥反應。

4參考文獻

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〔2013-12-19修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)