急性持續熱應激對兔血漿補體C3、溶菌酶含量及抗菌活性的影響

趙 川，黃光遠，熊權鑫，楊曉煉，黃慶洲

（西南大學榮昌校區動物醫學系，重慶 榮昌 402460）

為探討急性持續熱應激對肉兔抗病機能的影響，本試驗觀察了急性持續高溫對肉兔血漿補體C3、溶菌酶含量及血漿抗菌活性的影響，現將結果報告如下：

1 材料與方法

1.1 主要藥品 補體C3含量測定藥盒（批號：20141117），測試盒主要包括Tris緩沖液、PEG6000、C3抗血清；溶菌酶含量測定藥盒（批號：20140917），測試盒包括菌粉、菌粉溶劑、溶菌酶標準品等。以上藥盒均由南京建成生物工程研究所生產。

1.2 試驗用標準腸桿菌 ATCC25922株，購于中國獸醫藥品監察所。

1.3 主要儀器 紫外可見分光光度計，電熱鼓風恒溫干燥箱，立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器，超聲波清洗機，電熱恒溫水槽，低溫離心機，-40℃低溫冰箱，格力空調，微量移液器，肝素鋰一次性真空采血管、干濕溫度計、玻璃勻漿器。

1.4 試驗動物 70～80日齡成年新西蘭健康肉兔16只，雄性，體重2～2.5kg/只。由西南大學榮昌校區動物科提供。

1.5 動物飼料 精深兔料860ZQA兔配合飼料，由成都某農牧發展有限公司生產，批號為20140624。其中粗蛋白質≥16.0%、粗纖維10.0%～12.0%、粗灰分≤10.0%、粗脂肪≥2.0%、鈣0.5%～1.0%、鈣磷比（%）2∶1、氯化鈉 0.5%、水分≤12.5%、賴氨酸≥0.7%、消化能≥10.47MJ/kg。每千克飼料中主要微量元素的含量：銅（Cu）≤40mg、鐵（Fe）≥80mg、鋅（Zn）≥60mg；每千克飼料中主要維生素的含量：維生素A≥9000IU、維生素D≥900IU、維生素E≥40IU。

2 試驗方法

2.1 動物分組 試驗于2014年7月7日至20日在西南大學榮昌校區動物房內進行。將健康肉兔16只移入普通立體兔籠飼養，每籠兩只，自由采食和飲水。試驗期間外界環境溫度為27～32℃，在常規飼養一周，采食、飲水無異常情況后，轉入正式試驗。將肉兔隨機分為熱應激組（舍溫控制在35±1℃）和適溫組（舍溫控制在24±1℃），每組8只，每組單獨飼養。

2.2 飼舍溫度控制及熱應激處理時間 熱應激組：用200W紅外線保溫燈泡加熱，于試驗當天8：00開始逐漸升溫，至當日12：00飼舍溫度達到35±1℃（空氣濕度變化范圍為65%～75%），高溫持續時間為72h；適溫組：用空調降溫，于試驗當天8：00開始逐漸降溫，至當日12：00飼舍溫度達到24±1℃（空氣濕度變化范圍為65%～75%），適溫持續時間也是72h。

2.3 飼養方式 肉兔自由采食和飲水，每日上午8：00、18：00各飼喂1次。試驗期間測定兔采食、呼吸、心率、體溫等常規生理指標。

2.4 血漿的收集及保存 正式試驗從早上8：00開始，每隔 24 h后（即第 2 d早上 8：00），用肝素鋰真空采血管于兔的后肢外側靜脈采抗凝血5 mL，4℃、3000r/min離心5min，收集血漿，分裝于1.5mL指形管（0.5mL/管），-40℃保存，1月內待測。

2.5 血漿抗菌活性的測定 血漿抗菌活性測定采用王雷等[1]的改進方法進行。將標準腸桿菌用0.1mmol/L的磷酸鉀鹽緩沖液（pH 6.4）配成一定濃度的懸濁菌液（D570nm=0.3～0.5）。取 3mL該菌液與 50μL待測血漿于試管中混勻，測定其保溫前在570nm處的光密度值（D0），然后置于 37℃水浴 30 min，取出后立刻置冰浴中10min終止反應，測定其保溫后在570nm處的光密度值（D）。抗菌活力U按下式計算：U=[（D0-D）/D]1/2，菌液OD值每分鐘下降0.001定義為一個活性單位。

2.6 血漿溶菌酶含量的測定

2.6.1 試劑配制 （1）貯備菌液的配制。取5mg/支菌粉1支，倒入勻漿管中，加菌粉溶劑1 mL，用玻璃勻漿器輕輕緩慢旋轉研磨3min（切勿濺出），即得貯備菌液。將其取出后置2～8℃冰箱密封保存，一周左右內備用。

（2）應用菌液的配制。按貯備菌液與菌粉溶劑比例1∶19進行配制，現用現配，用時搖勻。

（3）溶菌酶標準品的配制。溶菌酶標準品貯備液的配制：在每支溶菌酶標準品內準確加入1.0mL雙蒸水，即配成2 mg/mL溶菌酶標準品貯備液（2～8℃保存）。標準品應用液的配制：先將溶菌酶標準品貯備液用雙蒸水10倍稀釋至20μg/mL后，再倍比稀釋至2.5μg/mL，即得溶菌酶標準品應用液，現用現配（2～8℃保存）。

2.6.2 溶菌酶含量測定 采用空白對照法測定溶菌酶含量，操作步驟見表1。

表1 空白對照法測定溶菌酶含量 mL

將表1中各管溶液分別混勻，37℃準確水浴15min，立即取出置于0℃以下的冰水浴中3min，逐管取出倒入1mL光徑比色皿中，530nm處以雙蒸水調透光度100%，比色，測各管透光度T15（T15即37℃水浴15min后的透光度值）。按下面公式計算溶菌酶含量：

溶菌酶含量（μg/mL）=[（測定透光度UT15-空白透光度OT15）/（標準透光度ST15-空白透光度OT15）]×2.5。2.5為標準品濃度（μg/mL）。

2.7 補體C3含量的測定 采用免疫比濁法進行，具體操作方法見補體C3含量測定藥盒的使用說明書。

2.7.1 標準曲線的建立 將低溫保存的特種蛋白校準品室溫下平衡20min，準確加入生理鹽水1mL溶解，即為1mg/mL蛋白校準液，再用生理鹽水按表2稀釋比例配成不同濃度的特種蛋白溶液。在波長340nm處用分光光度計測定OD值，以標準品濃度為X軸，吸光度OD值為Y軸，通過ELISACalc軟件建立標準曲線。

表2 校準程序

2.7.2 樣品C3含量的測定 將低溫保存的樣品常溫解凍，3h內進行。操作步驟按表3進行。

表3 C3含量的測定步驟

2.8 統計分析 試驗數據采用SPASS15.0統計軟件進行顯著性檢驗，結果用平均值±標準差（±S）表示。

3 試驗結果

3.1 急性持續熱應激下肉兔心率、呼吸頻率、體溫的變化 與適溫組比較，熱應激24h后心率呈增高趨勢，但差異不顯著（P＞0.05），48h后極顯著高于適溫組（P＜0.01），72 h后組間差異不顯著（P＞0.05）；呼吸頻率和體溫的變化趨勢基本一致，熱應激24、48、72h后，組間差異顯著或極顯著。熱應激組內不同時間點的比較：熱應激24h后的呼吸頻率與48、72h后比較差異極顯著（P＜0.01），24、48h的體溫與72h比較差異極顯著（P＜0.01）。具體變化見表4。

表4 各組肉兔的心率、呼吸頻率、體溫變化情況（±S）

表4 各組肉兔的心率、呼吸頻率、體溫變化情況（±S）

注：肩標*表示同一時間點組間比較（**表示P﹤0.01，*示P＜0.05）；肩標字母表示組內不同時間點比較（不同字母表示差異顯著或極顯著，相同字母表示差異不顯著P＞0.05）。 下同。

組別 測定指標24h 48h 72h熱應激組218.67±9.45232.56±4.41**216.33±11.42適溫組心率（次數/min）205.20±3.68202.20±11.12205.29±13.53熱應激組239.18±8.87a**206.25±5.21b**208.33±14.26b*適溫組呼吸頻率（次數/min）153.58±8.67167.44±5.26161.57±5.94熱應激組41.58±0.15a**41.13±0.25a**40.75±0.11b**體溫（℃）適溫組39.98±0.0639.74±0.1139.77±0.22

3.2 不同急性持續熱應激時間對肉兔采食量的影響熱應激組采食量在24、48、72h時均極顯著低于適溫組（P＜0.01），組內不同時間點肉兔采食量的差異均不顯著（P＞0.05）。具體結果見表 5。

表5 各組肉兔試驗期間的采食量變化 g/d

3.3 肉兔血漿抗菌活性的變化情況 與適溫組比較，熱應激 24h后差異極顯著（P<0.01），48、72h時差異不顯著；熱應激24h后與熱應激48、72h后相比差異顯著（P<0.05）。具體結果見表6。

表6 各組肉兔試驗期間的血漿抗菌活性變化 U

3.4 肉兔血漿溶菌酶含量變化 與適溫組比較，熱應激組在熱應激24 h后差異極顯著（P<0.01），熱應激 48、72h后差異不顯著（P＞0.05），但均值均高于適溫組；熱應激組內不同時間點比較，熱應激后24、48、72h，溶菌酶含量呈降低趨勢，但不同時間點間差異不顯著（P＞0.05）。具體結果見表7。

表7 各組肉兔試驗期間的血漿溶菌酶含量變化 μg/mL

圖1 C3含量標準曲線圖

3.5 肉兔血漿補體C3含量的變化

3.5.1 補體C3含量標準曲線 以標準品濃度為X軸，吸光度OD值為Y軸，建立標準曲線，結果見圖1。

3.5.2 補體C3含量的變化 與適溫組比較，熱應激24、48 h 后組間差異均不顯著（P＞0.05），熱應激 72 h后差異顯著（P＜0.05）；熱應激組內比較，熱應激24h后與48h后差異不顯著（P＞0.05），48h后與72h后差異顯著（P＜0.05）。結果見表 8。

表8 各組肉兔各時間點的血漿補體C3含量變化（±S）

表8 各組肉兔各時間點的血漿補體C3含量變化（±S）

g/L組別 24h 48h 72h熱應激組 0.19±0.03a 0.18±0.04a 0.15±0.02*b適溫組 0.18±0.04 0.19±0.04 0.18±0.06

4 分析與討論

4.1 本試驗表明，35℃急性持續熱應激下肉兔的心率、呼吸頻率、體溫整體呈升高變化，但采食量明顯減少。其發生原因與動物熱應激時中樞神經及外周交感神經興奮性增強，中樞及外周血液中去甲腎上腺素及腎上腺素分泌迅速增加，導致攝食中樞抑制、胃腸運動減弱、心率加快有關[2]。

4.2 血漿溶菌酶含量、防御素、抗菌活性等是機體抗病力高低的重要指標，其中溶菌酶因其能非特異性地破壞或溶解進入機體微生物細胞壁而得名，這些物質含量或活性的變化與機體抗病能力密切相關。本試驗結果表明，兔熱應激24h后，血漿抗菌活性及溶菌酶活性均呈增高變化，而熱應激48、72h后又基本恢復正常，提示肉兔熱應激早期可能處于防御機制的快速動員期，表現為抗應激能力及抗病力迅速增強，但隨著熱應激持續時間延長，血漿抗菌活性及溶菌酶活性變化呈恢復趨勢，可能與動物熱適應或抗病力減弱有關。關于熱應激對血漿溶菌酶及抗菌活力變化的影響，國內外報道得較多，但結果不盡相同。本試驗與陳昌福等[3]、趙萌等[4]的研究結果基本類似，即：血漿抗菌活性及溶菌酶含量呈先升高后降低的變化趨勢。

4.3 補體是存在于血清中的一組具有酶樣活性的球蛋白，正常情況下補體蛋白多以非活化的蛋白前體存在于血清[5]。補體系統在體內具有一套有效的免疫效應機制，具有殺菌、溶菌作用，并輔助和加強吞噬細胞和抗體的防御功能，是重要的非特異性免疫因子[6]。補體C3是補體系統的核心，血清中C3含量變化常與補體總量相平行，臨床上常作為檢測補體系統功能的主要指標，補體C3水平降低常反映機體免疫功能受損[7]。本試驗表明，在熱應激早期補體C3含量基本穩定，但中后期迅速降低。本試驗結果與張崇英等[8]報道的熱應激對錦鯉血清中C3含量的影響基本一致。

5 結論

肉兔在急性熱應激早期，抗病力會迅速增強，但中、后期抗病力或非特異性免疫力呈逐漸降低之勢。

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[3] 陳昌福，羅宇良，蔡冰.飼養水溫對草魚溶菌酶活性的影響[J].中國水產科學，1996（3）：25-31.

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