山慈菇提取液對小鼠4T1乳腺癌細胞抑制作用機制的研究

摘要：探索山慈菇提取液對小鼠4T1細胞抑制作用機制。采用水煎法制備山慈菇提取液，MTT比色法檢測小鼠4T1細胞的增殖活性，AnnexinV/PI雙染流式細胞術（FCM）檢測細胞凋亡。結果表明，山慈菇提取液對4T1細胞有明顯的增殖抑制作用（P<0.05）， 并呈劑量依賴關系。山慈菇提取液誘導小鼠4T1細胞凋亡效果明顯，并有劑量依賴性。山慈菇提取液對小鼠乳腺癌細胞有明顯的增殖抑制和誘導其細胞凋亡的作用。

關鍵詞：山慈菇；4T1細胞；增殖抑制；細胞凋亡

中圖分類號：R273 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）01-0134-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.01.035

山慈菇為蘭科植物杜鵑蘭Cremastra appendiculata（D.Don） Makino、獨蒜蘭Pleione bulbocodioides（Franch.）Rolfe或云南獨蒜蘭PLeione yunnanensis Rolfe的干燥假鱗莖。具有清熱解毒、化痰散結之功效[1]。是貴州著名的藥材之一，已被列入國家重點保護的藥用植物，具有很大的開發價值。在近年的研究中，以山慈菇為主要成分所展開抗腫瘤的研究也相對增多，林如輝等[2]、曾迪等[3]、吳俊林等[4]、夏文斌等[5]分別用山慈菇提取物誘導胃癌SGC-7901凋亡、侵襲肝癌SMMC7-721黏附能力、中藥山慈菇對甲狀腺癌細胞的促凋亡作用及腫瘤細胞毒活性篩選等試驗說明山慈菇具有抗腫瘤活性。文獻表明[6-12]，在現代臨床應用中山慈菇多以配伍的復方藥物及中藥處方治療乳腺增生、乳腺癌以及結合放化療，應用于肺癌、胃癌、大腸癌等多種惡性腫瘤的作用，具有明顯的治療效果，同時也減輕其臨床癥狀、癌疼痛等，延長生存期和提高生存質量。

本試驗通過研究山慈菇提取液對小鼠乳腺癌細胞4T1的增殖活性影響，探討山慈菇的抗腫瘤的機制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

4T1細胞購買于上海吉泰生物技術有限公司，山慈菇購于貴州省遵義市，MTT（博士德生物工程有限公司），細胞凋亡試劑盒（南京凱基），自動酶標儀（美國Thermo Multiskan GO）、流式細胞儀（德國PARTEC Cyflow Cube）

1.2 試驗方法

1.2.1 山慈菇提取液的制備 將山慈菇4 ℃浸泡過夜后，搗成細塊后，水煎法1 h制備水提液，旋轉蒸發儀濃縮至藥液濃度為生藥1.5 g/mL，過濾除菌，4 ℃保存備用。

1.2.2 細胞培養 4T1細胞培養于含10%小牛血清的DMEM培養液中，37 ℃、5% CO2及飽和濕度條件下培養，2～3 d換液傳代。取進入對數生長期的細胞，胰酶消化，PBS洗滌，用DMEM培養液調整細胞濃度為1×104/mL的單細胞懸液備用。

1.2.3 細胞增殖抑制試驗（MTT法） 將提取的山慈菇提取液分別按1.50、1.25、1.0、0.75、0.50 g/mL稀釋為5個濃度。對照組為等量PBS處理，空白組為不含細胞的培養液，每組設5個重復。將對數生長期細胞懸液接種于96孔培養板，每孔200 μL，標準條件下分別培養24 h后，加入對照組及實驗組對應藥液各20 μL。分別培養24、48、72 h后，每孔加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL繼續培養4 h，培養結束后，棄上清，每孔加入DMSO 150 μL ，震蕩10 min，于自動酶標檢測儀上490 nm波長下測定各孔OD值。

1.2.4 Annexin V/PI雙染檢測細胞凋亡 4T1細胞經1.5、1.25、1.0、0.75、0.50 g/mL濃度的山慈菇液作用24 h后，分別收集細胞1×106，冷PBS洗滌兩次，加入500 μL結合緩沖液，吹打均勻，加入Annexin V、PI各5 μL，混勻，避光染色15 min，上機檢測。

1.2.5 統計學分析 試驗數據采用SPSS16.0軟件包進行分析，所有數據均采用均數標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 MTT細胞增殖

由表1可知，山慈菇提取物對小鼠4T1細胞增殖有明顯抑制作用，不同濃度間的抑制作用有一定的差異。

2.2 Annexin V/PI雙染，流式細胞術檢測細胞

由圖1可知，山慈菇提取液對小鼠4T1乳腺癌細胞有不同程度的誘導細胞凋亡的作用。由圖2可知，早期凋亡圖示中顯示1.50、1.25、1.00 g/mL與對照組差異顯著（P<0.05）。在晚期凋亡中1.50、1.25 g/mL組與對照組差異顯著（P<0.05），具有統計學意義。圖3為凋亡細胞經Annexin V/PI雙染后的結果。

3 討論

山慈菇提取物作用4T1細胞出現明顯的細胞增殖抑制作用，細胞形態呈不同程度變化，細胞體積縮小，部分細胞連接消失，核質皺縮，胞內核內有微小顆粒，部分細胞出現死亡，高濃度的山慈菇提取液組尤為明顯，死亡細胞數量較多，說明山慈菇還具有一定的細胞毒性，應控制山慈菇的用量。Annexin V/PI雙染流式結果顯示山慈菇有明顯誘導細胞凋亡的作用，這一機制可能是山慈菇抗腫瘤活性的主要靶點。目前中藥化學成分的研究基礎較為薄弱，藥效基礎物質不是非常的明確。中草藥抗癌有效成分歸納為生物堿、萜類化合物、多糖類、酸類化合物、其他化合物等成分[13]。秋水仙堿是百合科植物的一種重要的生物堿，對細胞有絲分裂有明顯的抑制作用，在臨床中主要作為抗癌藥物使用，此外，對急性痛風性關節炎有特異的治療作用。我國主要從麗江山慈菇鱗莖中獲得秋水仙堿[14]。本試驗從山慈菇中提取含秋水仙堿的有效活性成分同樣具有抗腫瘤活性，而中藥抗腫瘤的多靶點效應也是抗腫瘤研究的其中一個機制，主要通過抗腫瘤血管生成、誘導細胞凋亡、抑制端粒酶活性等機制抑制腫瘤[15]。試驗結果表明，山慈菇對小鼠4T1乳腺癌細胞有明顯的增殖抑制作用，并且在一定的濃度作用下有明顯誘導細胞凋亡的作用。為進一步探討和研究山慈菇應用于臨床治療乳腺癌及其他癌癥的可行性提供一定的基礎。山慈菇生物活性較高，來源廣泛，現代臨床多作為抗癌中藥配伍使用，有望成為治療乳腺癌已及其他癌癥的有效藥物。

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