培養基的保存溫度對牛卵母細胞體外受精的影響

摘要：研究了培養基保存溫度對牛卵母細胞體外受精的影響。結果表明，基礎培養基中激素不同添加時間對牛卵母細胞體外成熟率、牛體外受精胚胎卵裂率及囊胚率差異不顯著（P>0.05）；提前添加激素在4 ℃不能長期保存，而在-20 ℃能長期冷凍保存，并不會對牛卵母細胞體外受精胚胎的發育產生太大的影響。

關鍵詞：培養基，保存溫度；牛；卵母細胞；體外受精

中圖分類號：S823 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）01-0137-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.01.036

牛體外受精技術（In vitrofertilization，IVF）一直是研究的熱點。近年來，隨著養牛業的發展，牛體外受精技術已日趨成熟。但由于體外受精技術操作環節復雜，操作過程涉及因素較多，以及卵母細胞、受精卵和早期胚胎對體外生存環境要求較高，使得試驗體系不穩定，可重復性差，進而影響試驗結果的準確性[1]。

目前牛胚胎的體外生產技術已得到很大提高，但是還存在著生產效率較低、培養體系不穩定等問題。筆者主要從培養基的不同保存溫度方面探討了培養基的保存條件對黃牛卵母細胞體外成熟及其體外受精的影響，旨在進一步尋求更為理想的培養基保存條件，從而為進一步提高動物胚胎體外生產的效率提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用的卵巢來自于武漢市牛屠宰點；冷凍精子來自于武漢市奶牛改良站。

1.2 試劑

成熟培養液（mTCM-199）：基礎培養基TCM-199（Gibco）+10% FBS+10 IU/mL人絨毛膜促性腺激素（HMG）+雌二醇（E2）+100 IU/mL雙抗。體外受精液：BO液，體外受精獲能液：BO液+5 mmol/L咖啡因+10 mg/mL肝素鈉+3 mg/mLBSA[2]。受精卵培養液：CRLaa。

1.3 試驗方法

1.3.1 卵母細胞采集及培養 母牛被屠宰剖腹后，立即無菌摘取卵巢，放入添加雙抗的25～35 ℃滅菌生理鹽水中4 h內送回實驗室。卵巢組織用滅菌且預熱的生理鹽水清洗3次，用10 mL無菌注射器（內有少量平衡后的DPBS）抽取卵巢表面直徑為2～8 mm的卵泡，抽取液注入15mL尖底離心管中，置于30 ℃的水浴鍋中。待COCS沉淀后，棄上清。將檢出的COCS用含體積分數為5%胎牛血清（FBS）的DPBS和成熟培養液各洗滌3次，移入含有成熟培養液滴的直徑為35 mm培養皿中。每個液滴100 μL并覆蓋石蠟油，每滴放COCs10～15枚。液滴預先在二氧化碳培養箱中平衡2 h以上。成熟培養條件39 ℃，5% CO2，相對飽和濕度。

1.3.2 體外受精

1）精子的處理。從液氮罐取細管凍精2支放入37 ℃水浴中30～40 s快速解凍，用75%乙醇消毒后剪開細管，將精子放入含有1 mL BO液的離心管中，二氧化碳培養箱中傾斜靜置1 h，使精子上浮，上浮后將上浮的精子用BO液1 500 r/min，5 min離心洗滌2次。

2）精子獲能處理。將離心洗滌的精子進行獲能15 min。

3）卵子的體外受精。將體外成熟培養22～24 h的卵母細胞，用0.25%的胰酶進行消化處理后，撿取有第一極體的卵母細胞進行受精。成熟卵子放入3×105個/mL獲能精子濃度的體外受精懸浮液滴，在與成熟培養液條件相同的條件下培養5 h，然后用受精卵培養液CRlaa（10～15枚/50 μL）進行體外培養[3]。

1.4 受精卵的體外培養

受精后的牛卵母細胞用已平衡好的受精卵培養液洗滌3～5次后，轉入50 μL受精卵體外培養微滴中，每滴10～15枚，在39℃、5% CO2、相對飽和濕度條件下培養48 h。受精后48 h觀察統計受精率和卵裂率。每隔24 h半量更換培養液，觀察受精卵發育情況。

1.5 試驗設計

①基礎培養基中激素不同添加時間（平衡時添加、提前添加后放4 ℃冰箱保存）對牛卵母細胞體外受精的影響；②成熟培養基mTCM-199不同保存溫度（4 ℃、-20 ℃）對牛卵母細胞體外受精的影響。

2 結果與分析

2.1 基礎培養基中激素添加時間對牛卵母細胞體外受精的影響

基礎培養基中激素添加時間對牛卵母細胞體外受精的影響見表1，結果表明，兩種添加方法（即在平衡培養基時添加激素與平衡前添加激素后放冰箱）對成熟率、卵裂率及囊胚率差異不顯著（P﹥0.05）。

2.2 成熟培養基mTCM-199在4 ℃時保存時間對牛卵母細胞體外受精的影響

由表2可知，成熟培養基mTCM-199在4 ℃時保存1周和2周對卵母細胞體外成熟率、卵裂率及囊胚率的影響不顯著（P﹥0.05）。但是隨著保存時間的延長，保存4、8周時對細胞體外成熟率、卵裂率及囊胚率均有顯著的影響，保存8周時胚胎發育停止，無囊胚的形成，囊胚率為0%。

2.3 成熟培養基mTCM-199在-20 ℃時保存時間對牛卵母細胞體外受精的影響

由表3可知，激素添加后放-20 ℃冰箱，保存時間1、2、4、8周時對卵母細胞體外成熟率和卵裂率的影響不顯著（P﹥0.05），但是隨著時間的延長，囊胚率明顯降低。

3 討論

體外受精技術是繼人工授精、胚胎移植技術之后，家畜繁殖領域的第三次革命，是生物工程的研究內容之一，它建立在受精生物學、早期胚胎發育機制等理論研究成果的基礎上。由卵母細胞的體外成熟、精子的體外獲能、卵母細胞的體外受精、受精卵的體外發育、配子和胚胎的冷凍保存及胚胎移植等程序組成的完整系統。

隨著胚胎工程技術的深入研究和商業化的推廣應用，對有效胚胎的需求量日益增加，僅靠體內生產牛胚胎遠遠不能滿足動物生產和科學研究的需要，因而，如何最大程度地提高胚胎的體外生產效率成為亟待解決的問題，體外受精技術為胚胎來源開辟了一個新途徑[4，5]。體外受精技術可利用屠宰場的卵巢生產大量、價廉、質優的胚胎，解決胚胎來源問題。體外受精技術包括卵母細胞的體外成熟、精子獲能、體外受精和早期胚胎的體外培養等環節，其中卵母細胞的體外成熟是最為關鍵的一步，牛卵母細胞體外成熟的影響因素很多，成熟卵母細胞體外成熟培養基尤為重要，

在體外受精研究中卵母細胞成熟的基礎培養液一般選用TCM-199，CRlaa，NUSC23和MEM等，其中在牛體外受精中應用最廣泛的是TCM-199。由于TCM-199的核苷、黃嘌呤和次黃嘌呤對卵母細胞核成熟有抑制作用的成分濃度相對較低，故其成熟培養的效果相對較好，牛、羊、豬等卵母細胞的核成熟率都在80%左右[6]，并且大量的實驗研究證明，成熟培養液還需要在上述培養液中加入血清FCS、NCS或ECS（5%～10%）以及促性腺激素LH和FSH（0.1 μg/mL）等[7，8]，然而，TCM-199的成分比較復雜，通常情況下都保存在4 ℃以確保其中的成分不發生化學變化而影響培養效果，筆者在偶然的情況下，發現經過-20 ℃短期冷凍，并不會很大程度由于影響卵母細胞的成熟及其后期胚胎發育，因此，筆者又進行了多次試驗，發現在黃牛卵母細胞體外成熟基礎培養液TCM-199-20 ℃短期冷凍，并不會對黃牛卵母細胞體外受精胚胎的發育產生太大的影響，這樣在一定程度上減少了培養基等試劑的浪費，并且更不容易污染，但是對胚胎進行冷凍或者移植是否有影響有待進一步的研究。

參考文獻：

[1] 劉新峰，郝志明，史遠剛，等.不同培養體系對牛卵母細胞體外受精的影響[J].安徽農業科學，2011，39（2）：1049-1050.

[2] 李海軍，靳木子，張睿彪，等.卵丘細胞凋亡與增殖對牛卵母細胞體外發育的影響[J].中國農業科學，2011，44（8）：1702-1709.

[3] 佟桂芝，董正德.影響奶牛體外受精胚胎培養效果的胚胎因素[J].當代畜牧，2007（1）：33-35.

[4] KNIGHT P G， GLISTER C. Local roles of TGF-βsuper family members in the control ofovarian follicle development[J]. Animal Reprod Sci，2003，78：165-183.

[5] VANDERHYDEN B C， MACDONALD E A， NAGYOVA E. Evaluation of members of the TGF-β super family as candidates for the oocyte factors that control mouse cumulus expansion and steroidogenesis[J]. Re-production，2003，61：55-70.

[6] 桑潤滋.動物繁殖生物技術[M].北京：中國農業出版社，2002.

[7] 崔亞利，桑潤滋.牛卵母細胞體外成熟及體外受精的研究[J].河北農業大學學報，1999，22（1）：67-72.

[8] 劉東軍，其木格.血清及BSA對牛體外受精胚胎發育過程超微結構影響的研究[J].細胞生物學雜志，2003（25）：55-59.