高效液相色譜—串聯(lián)質譜法測定獸藥制劑中的金剛烷胺

摘要：根據(jù)金剛烷胺的化學性質，結合已有提取方法與儀器公司給予的技術參考，采用高效液相色譜-串聯(lián)質譜法對獸藥制劑中金剛烷胺添加量進行檢測，建立了獸藥制劑中違禁藥物金剛烷胺的高效液相色譜-串聯(lián)質譜檢測方法。用5 %氨水甲醇∶異丙醇（4∶1）超聲提取試樣中違禁添加物金剛烷胺，以0.1 %甲酸/甲醇溶液進行梯度洗脫，采用電離噴霧電離方式（ESI+），通過多反應監(jiān)測（MRM）定量。該法靈敏度高，線性關系良好，相關系數(shù)r達到0.99，回收率在80.2%～99.8%之間，相對標準偏差（RSD）均小于8%。方法快速、簡便、精確度高、準確度高，適用于獸藥制劑中金剛烷胺違法添加的定性、定量分析。

關鍵詞：獸藥制劑；金剛烷胺；違禁藥物；高效液相色譜-串聯(lián)質譜

中圖分類號：O657.7+2；S959.79 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）01-0180-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.01.047

金剛烷胺又叫鹽酸金剛烷胺，為對稱的三環(huán)癸烷，于1960年首次合成，是國際醫(yī)學界公認對流感病毒有抑制作用的抗病毒藥物[1]，生產(chǎn)上主要用于雞、豬流感的預防和早期治療，禁止用于抗病毒獸藥、規(guī)模養(yǎng)殖場飼料等。但養(yǎng)殖戶存在濫用現(xiàn)象，對其毒副作用了解不足，用藥劑量偏高，常造成養(yǎng)殖動物中毒。

為避免影響國家動物疫病強制性免疫政策落實，給重大動物疫病防控工作帶來不良后果，農(nóng)業(yè)部于2005年以農(nóng)醫(yī)發(fā)[2005]33號文發(fā)布了《關于清查金剛烷胺等抗病毒藥物的緊急通知》，規(guī)定除經(jīng)批準生產(chǎn)、使用的疫苗產(chǎn)品外，禁止將金剛烷胺用于防治高致病性禽流感等一類病原微生物引起的病毒性疫病[2]。

目前國內尚未確定獸藥制劑中金剛烷胺殘留量測定的法定方法，文獻報道有動物源食品[3-9]、藥物[10-12]和人體血漿[13]中檢測，鮮見獸藥制劑中金剛烷胺殘留量測定方法的報道。本研究根據(jù)金剛烷胺的化學性質，以現(xiàn)有的文獻為基礎，采用高效液相色譜-串聯(lián)質譜法對獸藥制劑中金剛烷胺添加量進行檢測，經(jīng)分析，該方法檢測靈敏度高、專屬性強，對保障獸藥安全具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

ACQUITY Ultra Performance LC超高效液相色譜儀（美國，Waters公司），TQD串聯(lián)四極桿質譜儀（美國，Waters公司），離心機 HC-3518，渦旋混合器TALBOYS Advanced Vortex Mixer，KQ-500DB型超聲波發(fā)生器。

異丙醇和氨水（中國，天津市科密歐化學試劑有限公司），甲醇（美國，F(xiàn)isher公司），金剛烷胺標準品（德國Dr.Ehrenstorfer公司），試驗用水均為蒸餾水。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品前處理 準確稱取1.00 g試樣至50 mL離心管中，加入10.00 mL 5% 氨水甲醇∶異丙醇（4∶1）溶液超聲提取20 min，然后8 000 r/min離心5 min；用移液槍準確移取1.0 mL上清液至10 mL試管中，上清液用氮氣吹至近干，準確吸取1 mL 1∶9的0.1%甲酸水溶液∶甲醇溶液到該試管中，渦旋復溶，過0.22 μm濾膜至進樣瓶，進行儀器分析。

1.2.2 色譜條件 色譜柱C18柱（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）；柱溫35 ℃；流速0.3 mL/min；進樣量10 μL；流動相0.1%甲酸和甲醇，梯度洗脫程序見表1。

1.2.3 質譜條件 電離方式電噴霧電離（ESI+）；掃描方式正離子掃描；離子源溫度110 ℃；脫溶劑氣溫度380 ℃；錐孔氣流氮氣，流速50 L/h；去溶劑氣流氮氣，流速600 L/h；碰撞氣氬氣，碰撞氣壓3.50×10-4 MPa；檢測方式多反應監(jiān)測（MRM）；多反應監(jiān)測條件見表2。

2 結果與分析

2.1 方法的線性范圍

用基質空白將金剛烷胺標準溶液稀釋至適當濃度（0.00、0.05、0.10、0.20、0.50 mg/L）進行測定，以峰面積（Y）為因變量，相應的濃度（X）為自變量作圖。結果表明，金剛烷胺溶液濃度與對應的峰面積呈現(xiàn)良好的線性關系，相關系數(shù)為0.996 2。以信噪比（S/N）≥10計算，方法的定量限為0.5 mg/kg。

2.2 方法的回收率與精密度

按照SN/T0001標準的規(guī)定，禁用物質或未設定容許限的物質，一般選擇LOQ、2LOQ、10LOQ作為添加濃度水平進行回收率試驗，本方法用不含以上金剛烷胺的空白樣品基質進行3個濃度水平（0.5、1.0、5.0 mg/kg）的添加回收試驗，每個濃度水平進行6次重復試驗，測得各種農(nóng)藥的回收率范圍在80.2%～99.8%之間，RSD均小于8%。

2.3 提取溶液的優(yōu)化

金剛烷胺略溶于水，溶于乙醇、氯仿，不溶于苯和乙醚。研究者在測定復方氨酚烷胺膠囊中鹽酸金剛烷胺及對乙酰氨基酚的含量時采用水提取膠囊中的金剛烷胺[14]，也有人選擇流動相乙腈∶水（7∶3，m/v，g/mL，下同）來提取片劑中的金剛烷胺[15]；結合文獻的提取方法與儀器公司給予的技術參考，并考慮氯仿的毒性較大且與反相液相色譜的兼容性，分別考察了水、乙腈、乙醇、異丙醇、5%氨水甲醇∶異丙醇（4∶1）的提取效果，提取效果見圖1，最后選擇5%氨水甲醇∶異丙醇（4∶1）作為提取溶劑。

2.4 儀器條件的優(yōu)化

采用自動進樣，在正離子模式下進行條件優(yōu)化；選擇金剛烷胺最佳的分子離子峰以及其錐孔電壓，對碎片選擇及碰撞能量進行優(yōu)化；在優(yōu)化條件下，金剛烷胺的標準溶液色譜見圖2。

2.5 獸藥制劑中金剛烷胺非法添加情況

按照建立的方法對市面上收集的15批獸藥制劑喹氟寧、替米考星溶液、氟苯尼考粉、水溶性氟苯尼考（氟苯尼考粉）、心肝包治（恩諾沙星可溶性粉）、硫酸新霉素（硫酸新霉素可溶性粉）等進行金剛烷胺添加的普查，15份獸藥制劑均未檢出金剛烷胺添加。

3 結論

根據(jù)金剛烷胺的化學性質，結合已有提取方法與儀器公司給予的技術參考，采用高效液相色譜-串聯(lián)質譜法對獸藥制劑中金剛烷胺添加量進行檢測，建立了高效液相色譜串聯(lián)質譜-電噴霧正離子測定獸藥制劑中非法添加物金剛烷胺的檢測方法。該法快速、簡單、有效、回收率高，可很大程度上降低日常檢測過程中的檢測成本，縮短檢測周期，為獸藥制劑中非法添加金剛烷胺檢測提供了有效的前處理方法和檢測手段。

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