改良剛果紅法檢測分析羌族咂酒中的β—葡聚糖

摘要：分別采用標(biāo)準(zhǔn)酶法和改良剛果紅法，以市售啤酒為參照酒樣，對2種傳統(tǒng)羌族咂酒和2種新型咂酒（工業(yè)化咂酒）中的β-葡聚糖進(jìn)行了檢測及分析。結(jié)果表明，羌族咂酒富含β-葡聚糖，其中傳統(tǒng)咂酒中β-葡聚糖含量較高，為61.68～70.33 μg/mL，高于普通型新型咂酒（52.48～56.38 μg/mL）和清爽型新型咂酒（42.23～45.86 μg/mL）的含量（P<0.05）；參照酒樣百威啤酒和雪花啤酒的β-葡聚糖含量較低，分別為32.83～34.63、15.49～16.29 μg/mL。分析比較兩種測定方法的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)與標(biāo)準(zhǔn)酶法相比，除了傳統(tǒng)咂酒TZW-W的剛果紅法檢測數(shù)據(jù)偏高超過10%以外，其他5個酒樣的檢測數(shù)據(jù)偏差均小于10%，表明改良剛果紅檢測法有較高的準(zhǔn)確性和可信度，且具快速、簡便的優(yōu)點，是一種適合于工廠批量檢測酒品中β-葡聚糖含量的方法。

關(guān)鍵詞：羌族咂酒；β-葡聚糖檢測；改良剛果紅法；標(biāo)準(zhǔn)酶法；

中圖分類號：TS261.7；O656.25 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）01-0189-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.01.050

羌族是中國古老的民族，羌族咂酒具有上千年的歷史，羌族民間古詩《日主耶》對其釀造過程有詳細(xì)記述。傳統(tǒng)的羌族咂酒是以高原青稞為原料，經(jīng)固態(tài)發(fā)酵釀制而成的原汁酒，風(fēng)味獨特，營養(yǎng)豐富、酸甜爽口，深受當(dāng)?shù)乩习傩障矏踇1]。為了實現(xiàn)傳統(tǒng)咂酒的產(chǎn)業(yè)化，課題組對其工業(yè)化關(guān)鍵技術(shù)進(jìn)行了研究，以高原青稞為主要原料，輔以部分優(yōu)質(zhì)糯米，采用改良雙套酒技術(shù)，通過復(fù)配純種曲、優(yōu)化控制發(fā)酵過程以及原酒后處理過程，成功生產(chǎn)出新型羌族咂酒（工業(yè)化咂酒）。新型咂酒具有傳統(tǒng)咂酒的典型性，酒液棕黃明亮，醇厚爽口，其清澈度、色澤等外觀品質(zhì)優(yōu)于傳統(tǒng)咂酒[2]。

低度原汁釀造酒與蒸餾酒的顯著區(qū)別之一，就是原料中含有益于人體健康的物質(zhì)，通過溶解或參與生物發(fā)酵過程，最后大部分仍然保留在成品酒液中，低度釀造酒的營養(yǎng)保健價值總體上高于蒸餾酒，如啤酒被譽(yù)為“液體面包”、黃酒更是被稱為“液體蛋糕”。咂酒與黃酒類似，其營養(yǎng)保健功效同樣不容忽視。

β-葡聚糖是天然的益生元，具有降血脂、降膽固醇、調(diào)節(jié)血糖和預(yù)防心血管疾病等作用，是近年來的研究熱點。而青稞是β-葡聚糖含量較高的糧食作物，含量可達(dá)6%～9%，是其他主要糧食作物的數(shù)倍[3，4]。β-葡聚糖是青稞胚乳細(xì)胞壁的主要成分，是分子量為107～108的高分子化合物，因產(chǎn)地、品種及雨水條件而異，含量一般為6%～9%。酒類中的β-葡聚糖因受到不同程度分解、水解，其分子量一般為103～104， 在0～100 μg/mL范圍內(nèi)剛果紅與β-葡聚糖的結(jié)合具有高度的專一性[5]。以青稞為主要原料的咂酒，在釀造發(fā)酵過程、貯酒過程、后處理中的過濾工序會利用或減少一部分β-葡聚糖，有關(guān)咂酒產(chǎn)品中最終的β-葡聚糖含量鮮見研究報道。

本研究以傳統(tǒng)咂酒和新型咂酒為對象，以市售啤酒為參照酒樣，采用改進(jìn)的剛果紅法，檢測其中的β-葡聚糖含量，同時用國際標(biāo)準(zhǔn)酶法試劑盒進(jìn)行平行檢測，以驗證所用改良剛果紅法的準(zhǔn)確度并進(jìn)行比較分析。

1 材料與方法

1.1 樣品與試劑

傳統(tǒng)咂酒：2個酒樣，簡記為TZW-L和TZW-W，分別來自阿壩州理縣和汶川縣，采用傳統(tǒng)羌族咂酒釀造工藝。原料為100%青稞，曲為小曲，固態(tài)糖化發(fā)酵2周后加原料質(zhì)量60%的溫開水浸提而得。為研究需要，用正壓桶式過濾器（0.45 μm濾膜） 過濾并滅菌（80 ℃，10 min）后貯于冰箱中。2012年釀造。

新型咂酒：新型羌族咂酒由阿壩高原綠谷食品有限公司提供，原料為70%的青稞和30%的粳糯，采用工業(yè)化咂酒釀造工藝，2個酒樣（2012年產(chǎn)品），其中一個酒樣為清爽型咂酒（在發(fā)酵期加入了適量的酶制劑），簡記為CZW-Q；另一個為普通型，簡記為CZW-P。

供試咂酒的酒精度7.0%～13.8%（V/V），總酸5～8 g/L（以乳酸計），pH 3.8～4.2。

參照酒樣：9°P雪花純生啤酒，10°P百威啤酒，2012年產(chǎn)品，分別簡記為BW-S和BW-B。

試劑：β-葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品[Sigma-Aldrich （Shanghai） Trading Co. Ltd生產(chǎn)]；剛果紅（TCI公司生產(chǎn)）；β-葡聚糖酶法測定試劑盒（愛爾蘭Megazyme公司生產(chǎn)，100 Assays per Ki）；其他試劑均為市售分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

正壓桶式過濾器（浙江海寧過濾設(shè)備公司生產(chǎn)）；紫外-可見分光光度計（Shimadzu公司生產(chǎn)， UV2100型）；電子天平（賽多利斯公司生產(chǎn)，BT25S型， 精度為0.01mg）；酸度計（上海雷磁儀器廠生產(chǎn)，HS-25型）。

1.3 試驗方法

1.3.1 改良剛果紅法

1）Congo Red溶液配置。精密稱取0.100 0 g 剛果紅溶于pH 8.0的0.2 mol/L磷酸緩沖液中，定容至1 L，避光保存。

2）β-葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。標(biāo)準(zhǔn)曲線建立參考李永仙等[6]的方法并有改進(jìn)。取8組試管，除0號管為1只外，其余為3只平行管，按表1將標(biāo)準(zhǔn)β-葡聚糖溶液進(jìn)行稀釋。然后在以上各試管中分別加4.0 mL剛果紅溶液搖勻，20 ℃準(zhǔn)確避光反應(yīng)12 min，在550 nm處測定吸光度，以0號管中反應(yīng)液做空白調(diào)零。

3）供試酒樣中β-葡聚糖的檢測。傳統(tǒng)咂酒和新型咂酒先用去離子水稀釋1倍，啤酒不稀釋，取2 mL供試酒樣，加入4.0 mL剛果紅溶液搖勻，20 ℃避光反應(yīng)12 min后在550 nm處測定吸光度（A1）。為了消除酒樣顏色的本底影響，測定了各酒樣未加剛果紅溶液時的吸光度（A0），則供試樣品的真實吸光度ΔA=A1-A0。均以重蒸水做空白調(diào)零，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，以ΔA值計算得出供試樣品中的β-葡聚糖含量。4次重復(fù)。

1.3.2 國際標(biāo)準(zhǔn)酶法檢測 為了檢驗剛果紅法測定β-葡聚糖的適合度及準(zhǔn)確性，采用標(biāo)準(zhǔn)酶法對供試酒樣β-葡聚糖進(jìn)行了檢測。按照β-葡聚糖酶法測定試劑盒操作說明計算β-葡聚糖的含量。2次重復(fù)。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理 采用DPS12.05統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試酒樣中β-葡聚糖含量

2.1.1 剛果紅法測定結(jié)果 按表1所得β-葡聚糖稀釋溶液進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，得到回歸方程：y=0.004x+0.043 3（R2=0.988 7）。其中y為550 nm處的吸光度，x為β-葡聚糖的含量。4次重復(fù)測的β-葡聚糖的含量見表2。

2.1.2 國際標(biāo)準(zhǔn)酶法測定結(jié)果 按照β-葡聚糖酶法測定試劑盒操作說明測定的β-葡聚糖含量情況見表3。

2.2 供試酒樣中β-葡聚糖含量分析

2.2.1 改良剛果紅法的準(zhǔn)確度和適用性 從表2和表3的測定結(jié)果進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)酶法的β-葡聚糖含量均低于剛果紅法的測定結(jié)果，說明剛果紅法測定β-葡聚糖易導(dǎo)致數(shù)據(jù)偏高。但是從偏高的程度分析， TZW-L和TZW-W分別偏高8.64%和10.42%，屬于較高范疇；而新型咂酒和啤酒的剛果紅法檢測結(jié)果只比標(biāo)準(zhǔn)酶法偏高5.16%～8.43%。表2和表3均顯示新型咂酒和啤酒中β-葡聚糖含量少于傳統(tǒng)咂酒，說明剛果紅法檢測的結(jié)果相對更準(zhǔn)確。

總體上看，除了TZW-W的剛果紅檢測數(shù)據(jù)偏高，超過10%以外，其他5個酒樣的檢測數(shù)據(jù)偏差均小于10%；表2中RSD只有2.42%～6.11%，平均僅為3.31%，說明該試驗方法波動性小、重現(xiàn)性強(qiáng)。

標(biāo)準(zhǔn)酶法測定準(zhǔn)確度高但耗時長，一次檢測約需16 h，與之相比，剛果紅法快速簡便，結(jié)果具有較高準(zhǔn)確度和可信度，適合工廠化大批量檢測。

2.2.2 酒樣中β-葡聚糖含量的比較與分析 從表2可見，TZW-L和TZW-W中β-葡聚糖分別為72.54 μg/mL和68.11 μg/mL，兩者差異不顯著，但均顯著高于新型咂酒和啤酒中含量；CZW-Q和CZW-P的β-葡聚糖分別為45.86、56.38 μg/mL，傳統(tǒng)CZW-P顯著高于CZW-Q，原因可能是CZW-Q發(fā)酵過程中添加的酶制劑，降解與轉(zhuǎn)化了部分發(fā)酵醪液中的物質(zhì)，包括β-葡聚糖，導(dǎo)致含量降低。

新型咂酒中β-葡聚糖平均含量為51.12 μg/mL，傳統(tǒng)咂酒中的平均含量為70.33 μg/mL，前者比后者低約27%，可能是新型咂酒發(fā)酵度較高，其中的β-葡聚糖分解更充分；新型咂酒經(jīng)過清酒罐沉淀和兩次過濾（傳統(tǒng)咂酒一般不過濾，但在本次試驗中，為檢測需要進(jìn)行了一次過濾），較大分子的β-葡聚糖被濾布（膜）截留更多，其含量相對更少。β-葡聚糖是益于人體健康的功能物質(zhì)，但在咂酒中并非越多越好，超過一定含量容易引起非生物性渾濁現(xiàn)象發(fā)生，其含量應(yīng)控制在適當(dāng)范圍。經(jīng)工廠實踐發(fā)現(xiàn)，凡是β-葡聚糖含量超過65 μg/mL的新型咂酒貯存1年后，酒腳明顯增多；而含量低于55 μg/mL的不易引起渾濁和沉淀。

啤酒的主要原料是大麥（芽），羌族咂酒的主要原料是青稞，屬于大麥的一種，又稱“裸大麥”，從原料相似性方面考慮，選取市售啤酒為參照酒樣。比較2種參照酒樣百威啤酒和雪花啤酒的β-葡聚糖含量，百威啤酒顯著地高于雪花啤酒，2種啤酒的β-葡聚糖含量均顯著地低于4種咂酒，甚至不及傳統(tǒng)咂酒的50%，表明原汁發(fā)酵的咂酒的營養(yǎng)物質(zhì)比啤酒高；也證明咂酒是富含β-葡聚糖的功能性酒品。

3 討論

β-葡聚糖具有特殊生理活性，近年來其研究與開發(fā)升溫。在歐美市場，β-葡聚糖銷量呈現(xiàn)上升趨勢[7]，β-葡聚糖的檢測越來越受到重視，在諸多檢測方法中，標(biāo)準(zhǔn)酶法的準(zhǔn)確度得到公認(rèn)，但是需要購買進(jìn)口的昂貴試劑盒，測定時間長（13～16 h），且試劑保存期限短[8，9]，該法并不太適合工廠化批量檢測。剛果紅法快速簡便，結(jié)果具有較高的準(zhǔn)確度和可信度，適合工廠化大批量檢測。

豐水平等[10]通過SKALAR流動分析儀檢測，得出9°P雪花純生啤酒中β-葡聚糖含量為17.6 μg/mL，8°P雪花精制啤酒的β-葡聚糖含量為19.7 μg/mL，10°P百威干啤的β-葡聚糖含量為36.6 μg/mL，與本次試驗中對應(yīng)啤酒的β-葡聚糖含量水平相當(dāng)，表明采用改良剛果紅法檢測結(jié)果具有較高的準(zhǔn)確度。在實際工作中用改良剛果紅法測定β-葡聚糖含量時，應(yīng)選用高純度剛果紅試劑，β-葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)購買Sigma公司產(chǎn)品，溶解剛果紅的磷酸緩沖液的濃度和pH應(yīng)準(zhǔn)確，在估計測試樣品中β-葡聚糖含量較高時，應(yīng)先稀釋再檢測。

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