木質素過氧化酶對雙酚A類化合物的分子動力學模擬

摘要：為了解雙酚A類化合物（BPAs）與木質素過氧化物酶（LiP）結合位點的結合構象及其相互作用機理，采用SYBYL-X1.3中分子對接的方法對BPA、BPF、BPAF、BPQ、BPB、BPC、BPS、BPE、BPAP等具有突出特點的雙酚A類化合物與LiP進行對接研究，并利用GROMACS軟件進行分子動力學模擬。通過對對接最穩定化合物BPQ和常用化合物BPA的模擬參數具體分析，找到了LiP的活性位點為HIS39、MET172、ALA175、HIS176、ILE42、ALA179、PHE193、ARG43、ILE235和PHE46；找到了該酶被識別的氫鍵結合位點中的氨基酸殘基，BPQ通過氫鍵連接了PRO83.O（id141）、ASP183.OD2（id470）和ASN182. HD21（id1221），而BPA通過氫鍵連接了PRO83.O（id141）、ARG43.HH21（id818）。氨基酸殘基對LiP與雙酚A類小分子化合物的降解起到重要作用。

關鍵詞：木質素過氧化物酶；雙酚A；分子對接；分子動力學模擬

中圖分類號：Q554 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）01-0220-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.01.058

雙酚A類化合物是一種類雌激素，在塑料制品生產過程中可作為阻燃劑、抗氧化劑、硬化防止劑、聚合抑制劑和增塑劑等[1]，在水杯、奶瓶、食品包裝、飲料容器、醫療設備上被廣泛使用，且越來越多地應用在新產品的開發上。由于其難降解，該類化合物會緩慢地釋放到周圍的環境中，并在環境中積累，通過空氣、水、土壤以及食品污染物（塑料垃圾）等途徑引起人體畸形、癌變、內分泌失調、新陳代謝紊亂[2，3]，成為了繼“溫室效應”，“臭氧層空洞”后第三大威脅人類健康的熱點。因此，尋找并用正確的方法處理環境中的雙酚A類化合物已迫不及待。

作為木質素生物降解過程當中的酶類，木質素過氧化物酶（Lignin Peroxidase，LiP）以過氧化氫為電子受體并以鐵撲啉作為輔基，其催化反應遵循傳統過氧化或者氫氧化催化機理[4]。1988年Tien等[5]首次從白腐真菌屬的黃孢原毛平革的限制性培養基中發現了LiP并且認定該酶為氧化還原酶。研究發現，LiP的作用底物比較廣泛，主要有酚類和非酚類芳香化合物質，也包括苯并芘等多環芳烴[6]。

分子對接是研究小分子與大分子物質相互作用模式、生物大分子之間的相互識別的常用方法之一[7]。分子動力學模擬是利用計算機軟件對生物或化學反應的過程進行模擬（包括反應的條件，如溫度、水環境、氣壓、酸堿性等），還可以用來預測蛋白質的結構、研究酶促反應的過程與機制以及蛋白質（酶）與小分子（配體）的相互作用機理等，為某些酶促反應、藥物設計與藥理作用研究提供理論依據[8，9]。林錦霞等[10]用分子對接的方法研究了短小芽孢桿菌木聚糖酶與底物木聚糖的作用，也有學者利用分子對接和分子動力學模擬的方法研究蛋白質配體和受體的作用機理[11]。目前，有關LiP催化降解雙酚A類化合物的研究鮮見報道。因此，本研究選取了幾種常見的雙酚A類化合物，利用分子對接軟件和分子動力學模擬軟件，將LiP與幾種小分子雙酚A類化合物進行對接，尋找酶的活性位點，并對對接效果最好的小分子物質進行動力學模擬，了解其相關作用機制，為LiP催化代謝雙酚A類化合物提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 數據來源

試驗中選取的9種化合物包括：2，2-雙（4-羥基苯基）丙烷（簡稱BPA）、4，4-二羥基二苯基甲烷（簡稱BPF）、2，2′-二（4-羥基苯基）-六氟丙烷（簡稱BPAF）、2，2-雙（2-羥基-5-聯苯基）丙烷（簡稱BPQ）、2，2-二（4-羥基苯基）丁烷（簡稱BPB）、4，4′-（1-甲基亞乙基）雙（2-甲基苯甲醚）（簡稱BPC）、4，4-二羥基二苯砜（簡稱BPS）、4，4′-亞乙基雙苯酚（簡稱BPE）、4，4-（1-苯乙基）雙酚（簡稱BPAP），其共同特點就是具有兩個或多個芳環并共同連接到一個中心C上，各種化合物的結構式如圖1所示。

1.2 計算及模擬方法

LiP在RCSB Protein Data Bank—RCSB PDB中有多種構型，本試驗參照馮義平等[12]關于LiP催化去除水中雌激素的研究，選取酶晶體結構1B82，以此物質作為分子對接和動力學模擬的蛋白質受體。

LiP與雙酚A類化合物的分子對接：分子結構進行能量最小化的優化（Tripos力場進行），采用最陡下降法-共軛梯度法[13]，設置能量收斂值為0.005 kJ/（mol·？魡），優化次數設置為1 000，最后進行加電荷并負載Gasteiger-Hückel電荷[14]。為了研究的簡化，除去LiP（1B82.pdb）中兩條完全對稱的B鏈中的一條，為蛋白質加載電荷加氫，固定所有的氫原子。采用AMBER7 FF99力場對蛋白質進行修復和能量最小化優化。對接過程以CH4、C=O、N-H為分子探針，指定原型分子的探測方式為配體，閾值默認值為0.5，其他參數為默認值[15]，進行對接。對接之后找出對接效果最好或有代表性的物質進行分子動力學模擬。

SYBYL-X1.3軟件中Total_Score為總的Surflex-Dock得分，其值愈大說明對接復合物越穩定[16]。基于選擇小分子的原則，本試驗中主要考慮以下兩點：一是選取對接效果最好的進行模擬；二是從實際情況出發，雙酚A普遍存在于自然環境中，而且雙酚A類物質含量大大低于BPA，如何去除BPA的危害也將是今后研究的重點。本試驗模擬將選取BPA和另外一種對接效果最好的小分子分別進行分子動力學模擬。

分子動力學模擬：體系模擬在Linux系統中的GROMACS[17]軟件上進行。采用GROMOS96 43A1力場條件，定義晶胞和添加溶劑。模擬系統使用立方體水盒子，蛋白質與水盒子壁的最小距離為1 nm，并且加入了Na+，用以維持系統環境的性質為中性。用最陡下降法進行能量最小化，設置小分子化合物與蛋白質分子為同一整體，并進行系統平衡[18]。系統平衡包括正則系統NVT平衡和等溫等壓NPT平衡，兩步平衡以保證完全平衡每個系統的性質[19]。最后，在水環境恒溫300 K的系統平衡條件下，對試驗進行了10 000步數動力學模擬。

2 結果與分析

2.1 分子對接結果分析

將LiP與雙酚A類小分子化合物進行分子對接，得到的分子對接結果如圖2所示，其結果數據見表1。由表1可知，BPQ的總值得分最高，說明其與Lip對接最牢固，與LiP的對接穩定性比其他雙酚A類化合物好。由于BPA是雙酚A類化合物的典型代表，而BPQ與LiP的對接得分最高，對接效果最好，所以選擇BPA和BPQ進行模擬分析。

過氧化酶結合位點的結構特性對于其與底物的結合有重要意義。通過SYBYL軟件，可以找出小分子化合物與LiP的結合位點，圖3中BPQ、BPA活性位點處的氨基酸殘基均為HIS39、MET172、ALA175、HIS176、ILE42、ALA179、PHE193、ARG43、ILE235和PHE46。在距離LiP活性位點5 ？魡范圍內的蛋白質結合位點的氨基酸殘基有HIS39、PRO145、

GLU146、PRO147、GLU40、MET172、LEU173、SER174、ALA175、HIS176、ILE42、VAL178、ALA179、ALA180、ARG43、PHE193、ILE235、LEU44、SER237、PHE265、VAL45、PHE269、LEU272、PHE46和HIS47。

氫鍵在受體和配體的相互結合過程中發揮著重要作用，研究結合位點上的氨基酸與配體鍵的距離可以反映受體和配體之間是否發生相互作用。利用SYBYL軟件還可以識別氫鍵連接的位點，即找到并生成氫鍵的供體和受體。圖4顯示小分子化合物BPQ、BPA通過氫鍵連接的氨基酸殘基位點和小分子在酶腔體中的位置。從計算結果得知，當BPQ與LiP進行對接時，氫鍵與酶的3個氨基酸殘基相連，它們分別是PRO83.O（id141）、ASP183.OD2（id470）和ASN182.HD21（id1221）；當BPA與LiP進行對接時，氫鍵與酶的2個氨基酸殘基相連，分別是PRO83.O（id141）和ARG43.HH21（id818）。將二者進行比較可知，BPQ、BPA與LiP對接之間的氫鍵有一個共同的受體，那就是氨基酸殘基PRO83.O（id141），說明該氨基酸殘基在雙酚A類化合物與LiP的反應過程中起著重要作用。在BPQ、BPA與LiP對接的過程中，不僅存在著氫鍵的作用，而且還存在著疏水力的作用。LiP活性位點附近親水面和疏水面如圖5所示。LiP活性位點附近的親水面和疏水面分別作為氫的受體和供體的兩個原子，如果二者在3.5 ？魡距離范圍內，則可能存在親水作用，如果蛋白質中的某個疏水集團抑制劑分子在6.5 ？魡距離內，則二者之間可能存在某種疏水相互作用。由表2中的作用原子鍵長可知，BPA和BPQ分別在蛋白質活性位點的空腔內形成親水相互作用。

2.2 動力學模擬結果分析

分子動力學模擬是在水環境中完成，體系的溫度為300 K，壓力為1.018個大氣壓[20]。溫度、壓力及勢能均達到收斂，說明分子動力學模擬正常。模擬過程中將配位蛋白質（LiP）相對于初始結構的均方根偏差RMSDs值作為衡量體系是否穩定的指標，即檢查能量項的收斂情況[21]。在本試驗中蛋白質復合物相對于初始結構的均方根偏差如圖6所示。在10 000 ps的分子動力學模擬過程中，小分子BPA和BPQ對蛋白質的影響不同，未結合任何小分子的蛋白質在3 000 ps后基本趨于穩定，而結合了BPA的蛋白質復合體的RMSDs值波動明顯，且在8 000 ps時呈上升趨勢，這說明小分子BPA的結合增加了蛋白質柔性，而結合了BPQ的蛋白質復合體RMSDs表現與未配位蛋白RMSDs一致，說明了BPQ與酶結合更穩定，BPA比BPQ對LiP酶構象的誘導更顯著。

酶和底物結合以后，不僅LiP的構象會改變，小分子的構象也會發生變化，這種變化使得底物更接近于過渡態，可以降低活化能。除了分析蛋白質結構的變化外，本試驗同時分析了小分子配體BPQ、BPA在分子動力學模擬過程中結構的變化。圖7為小分子配體相對于初始結構的均方根偏差（RMSDs）。BPQ的RMSDs值在0～3 000 ps時波動明顯，3 000 ps之后則在0.275 nm周圍穩定波動，說明BPQ在結合位點附近經歷構象的改變；而BPA的RMSDs值在3 000～8 000 ps起伏變化較大，說明在酶催化反應中底物BPA經歷了較多的構象選擇；通過對比兩種小分子配體RMSDs值可知，BPA比BPQ的上下波動更明顯，說明BPA不容易與LiP形成穩定結構，在酶空腔中較難尋找到最適構象。

回旋半徑用于度量結構的緊密度，其未配位蛋白質（LiP）骨架碳原子及其配位后蛋白碳骨架回旋半徑（Rg）[22]如圖8所示。BPQ體系和BPA體系的Rg不同程度變大，說明體系發生了膨脹。其中兩個系統的Rg值變化趨勢基本是相同的，說明未配位蛋白質、蛋白質與BPQ結合的復合物構象改變的影響是適度的；但是可以明顯看出，酶在配位后，BPA的蛋白質的回旋半徑變化范圍比BPQ的大，證明BPQ對酶的結合更穩定，容易形成過渡態從而加快酶對BPA催化，而BPA對LiP有更多誘導。

三次蛋白質（LiP）骨架碳原子的基于殘基分析的均方根波動（RMSFs）[23]分析如圖9顯示。由圖9可以看出，無配體和有配體的復合物結構對部分殘基的柔性的改變是一樣。結果表明，蛋白質與小分子反應時氨基酸殘基柔性發生改變，即小分子與氨基酸殘基發生碰撞位點的變化。

BPA和BPQ經過10 000 ps的分子動力學模擬后，在6.5 ？魡之內與蛋白活性位點的相互作用力主要是疏水作用，其情況如圖10所示（睫毛鍵表示疏水力）。由圖10可以看出，6.5 ？魡距離內，BPQ與活性位點Val184、Glu146、His82、Ile85、Phe193、Arg43、Glu40、His39、Ala180、Asp183、Asn182、Val181、Pro145、Pro83、Pro147、His47總共16個氨基酸殘基存在疏水作用；同樣，BPA與Met172、Leu169、Val158、Glu146、His176、Ile154、Ile235、Ser237、Pre145、Pre147、His47、Leu173、Phe46共13個氨基酸殘基也存在疏水作用。雙酚A類小分子與LiP之間的非鍵相互作用有利于底物的代謝。

3 小結

通過分子對接和分子動力學模擬進行LiP與BPQ、BPA的相互作用研究，結果表明LiP催化降解BPAs的反應能夠自發進行，小分子與酶之間通過氫鍵連接，BPQ、BPA與LiP的結合位點處的氨基酸殘基為HIS39、MET172、ALA175、HIS176、ILE42、ALA179、PHE193、ARG43、ILE235和PHE46。對接時小分子在蛋白質空腔內是親水性質且呈現彎曲結構，在10 000 ps的分子動力學模擬過程后，BPQ和BPA在LiP活性位點疏水力發揮極大作用。由此可見，雙酚A類化合物中疏水作用激活了LiP。另一方面，BPQ和BPA經歷了較大的結構變化，底物分子BPA的結構變化更為明顯，BPA引起的LiP結構的變化也比BPQ要大，可以看出LiP可能被小分子BPA的誘導比BPQ顯著，并在此基礎上蛋白質發揮了更進一步的催化代謝作用。因此，推測LiP與BPQ的結合能力比BPA強，但是BPA分子結構以及酶體積和形狀的變化程度更大，BPA比BPQ在酶活性中心也會經歷更多的催化代謝途徑。

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