柴油降解酵母復合菌的篩選、鑒定及培養條件優化

摘要：以柴油為惟一碳源，用富集、馴化培養基從舟山港口柴油污染海水和海泥中篩選得到4株高效柴油降解酵母菌（Yeast）C1、C2、D1、D3，其柴油降解率為（70.49±2.50）%～（78.76±1.24）%。對4株菌進行3菌和4菌的相同比例的隨機組合構建混合菌群，從中篩選得到最佳柴油降解復合酵母菌S1-5（C2+D1+D3），降解率達到（85.30±1.29）%。再通過形態學觀察、生理生化特征分析及16S rDNA、26S rDNA測序等方法對構成最佳降解復合菌的3株單菌進行鑒定。通過分子鑒定，得到酵母菌C2、D1、D3都是耶羅維亞酵母屬（Yarrowia），其中C2和D3是解脂耶羅維亞酵母（Yarrowia lipolytica）。在模擬污染水域實際物化條件的基礎上優化培養條件，優化試驗獲得酵母復合菌S1-5的最佳培養條件為鹽度30‰，NH4NO3 1.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.3 g/L，KCl 1 g/L，FeCl3·6H2O 50 mg/L，在該條件下其降解率達到（82.79±1.38）%。

關鍵詞：酵母菌（Yeast）；柴油降解；篩選；鑒定；優化

中圖分類號：X172 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）02-0318-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.02.012

隨著經濟的發展，人類對能源的需求量日益增加，對油氣資源的利用開發也日益加強，柴油就是其中之一。柴油是石油提煉后的一種油質產物，由不同的碳氫化合物混合組成。它主要作為汽車、飛機、鐵路車輛等運載工具或其他機械用器的燃料，也可用來發電、取暖。但柴油用處廣的背后也存在隱患，因為石油是由飽和烴、芳香烴類化合物和少量的瀝青質、樹脂類等組成的復雜混合物，通過單一的石油降解菌難以將石油從環境中徹底去除[1-3]，而柴油身為其產物，亦是如此，所以就會造成難以自然去除的污染。

比如其含有較多雜質，燃燒時容易產生煙塵，造成空氣污染；在冶煉、儲存、運輸等過程中柴油產生的泄漏也會造成水體、土壤和大氣等環境污染[4]，并且油類污染物具有致癌、致畸、致突變等作用，容易在生物體內富集，嚴重危害和影響生態系統及人體健康[5]。因此對柴油污染采取人為措施十分必要，其中微生物處理相較于物理、化學方法較為突出，因為它的安全性高，無二次污染，且操作簡單。研究表明，環境中存在許多以石油類污染物為惟一碳源的微生物[6，7]，它們能夠快速、有效的去除石油類污染物。還有研究發現微生物在寒冷、鹽堿、厭氧等不利環境條件下也能降解柴油[8-10]。在微生物中，酵母菌處理又具一定優勢，因為其在處理負荷、需氧量和耐滲透壓方面具有較大優勢[11]，且酵母菌為真菌，在分解酶方面具有特異性[12，13]。

基于以上原因，本研究從港口柴油污染海水和海泥中篩選得到能高效降解柴油的酵母菌，并對其做了形態學觀察，生理生化和分子方面的鑒定，為酵母菌降解柴油的發展提供理論基礎。

2 結果與分析

2.1 柴油降解酵母菌的分離與純化

在可降解柴油的混合菌群中初步劃線分離篩選出15株酵母菌單菌落，純化后以液體石蠟做保護劑保種，于4 ℃冰箱保存備用。

2.2 柴油降解率的測定

將初篩得到的15株柴油降解菌置于含500 mg/L柴油的人工海水培養基中培養5 d后，用紫外分光光度法測定柴油降解率。在最大吸收峰225 nm的波長下測定標準柴油濃度的吸光度，得到以柴油濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標的標準曲線。標準曲線的回歸方程式為：y=0.004 5x-0.009 9，R2=0.993 9。式中，y為樣品吸光值；x為所測樣品的柴油濃度。

初篩降解菌的柴油降解率見表2。由表2可見，單菌株中C1、C2、D1、D3的降解率均超過70%，以D3降解率最高，為（78.76±1.24）%。另有9株菌的柴油降解率在40%～70%之間，其中C6、C7、C9、D5、D6菌株柴油降解率差異非常小，均在66%左右。

2.3 柴油降解菌的鑒定

對分離到的高效柴油降解酵母菌C2、D1、D3進行初步的形態觀察和生理生化鑒定。由形態觀察可知，酵母菌C2菌體呈桿狀或球狀，一般呈單個或成對；酵母菌D1菌體呈桿狀或球狀，一般呈單個；酵母菌D3菌體較C2、D1小，呈桿狀或球狀，一般呈單個。分析表3可知，酵母菌C2不能利用側金盞花醇，肌醇、山梨醇、D-乳糖、D-麥芽糖、D-松叁糖、D-棉子糖；酵母菌D1不能利用側金盞花醇。

將菌株C2，D1和D3的26S rDNA在GenBank中進行序列分析，構建系統發育樹，結果見圖1。由圖1可見，C2、D3均與Yarrowia lipolytica MO-Y5（GU373759）處于同一分支上，序列相似性很高，親緣關系最近。因此C2、D3菌株可初步鑒定為解脂耶羅維亞酵母。D1菌株較為特殊，游離于樹外，但距離較短，結合對單菌株重建系統樹發現其同樣與解脂耶羅維亞酵母同源，另圖1也顯示3株酵母在形態特征上有一定差異，其中C2和D3相似，D1菌株相對于前兩者顯示菌體略長，故初步鑒定D1菌為耶羅維亞屬（Yarrowia sp. D1）。

2.4 復合降解菌優化試驗

對上述篩選獲得的菌株進行簡單染色后，在光鏡下觀察其形態進行初步區分后，選取酵母菌菌株中柴油降解率較高的4株單菌作為混合菌的種子菌株。對種子菌株分別進行3菌和4菌的隨機等比例組合。酵母菌的5種復合菌組合在含500 mg/L柴油的人工海水培養基中培養3 d后，用紫外分光光度法測定柴油降解率。測定結果見表4，由表4可見，酵母菌復合菌降解率均在75%以上，其中有4個混合菌組合降解率達到80%以上，以S1-5（C2+D1+D3）的降解率最高，達（85.30±1.29）%。

選擇酵母菌混合菌S1-5及酵母菌中降解率最高的單菌（D3）在模擬污染水域實際物化條件的基礎上分析其柴油降解率。

培養條件的優化。將篩選得到的最佳降解復合菌接入鹽度分別為24‰、27‰、30‰、33‰的含500 mg/L柴油的人工海水培養基中，pH 8.0，28 ℃，150 r/min恒溫搖床中振蕩培養3 d后，測定柴油降解率，如圖2所示。

由圖2可見，酵母菌復合菌S1-5在鹽度24‰、27‰、30‰、33‰能正常生長，對柴油有較好的降解作用，最適鹽度為30‰，而單菌D3在鹽度為33‰時達到最佳降解效果。可見不同菌株的最適鹽度存在差別，而復合菌因為菌種之間存在相互作用，所適應的鹽度也會與單個菌株有所區別。

對人工海水培養基中NH4NO3、MgSO4·7H2O、KCl、FeCl3·6H2O 4個組分作4因素3水平正交試驗，配制9種不同的人工海水培養基，鹽度30‰，測定柴油降解率，其結果見圖3，酵母菌復合菌的最佳降解條件為A3B1C3D2，即NH4NO3 1.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.3 g/L，KCl 1 g/L，FeCl3·6H2O 50 mg/L，降解率達（82.79±1.38）%。

利用SPSS17.0軟件分析各因子對酵母復合菌S1-5降解率的影響。NH4NO3及FeCl3·6H2O對復合酵母菌對柴油的降解率都有很大的影響（P<0.01），其影響排序為NH4NO3>MgSO4·7H2O>FeCl3·6H2O>KCl。結合單因素統計量表中的均數估計發現A3、B1、C3及D2均數最大，降解率分別達到74.874 3%、73.636 3%、71.659 0%及71.733 7%。經SPSS分析預計酵母菌復合菌S1-5的最佳培養條件為A3B1C3D2，與前述相同。

對石油污染海水進行處理時，石油成為石油降解菌可利用的生長元素來源，但石油主要提供的為C、H元素，其他元素（特別是N、P、金屬離子）的缺乏可能導致石油難以被降解。培養基中添加低濃度的Mg2+、K+和Fe3+都能促進細菌復合菌對石油烴的降解，這是因為微生物在生長過程中需要這些微量元素[16，17]。研究表明，不同氮磷比對菌株的生長和石油烴的降解是有一定影響的，適量的氮磷的添加可以促進微生物的生長。同時添加外源營養物，并非越多越好，只有在一定量的范圍內才能具有促進作用[18]。

3 小結

從舟山某港口被柴油污染的海水和海泥中篩選得到4株高效柴油降解酵母菌C1、C2、D1、D3，通過測量，得到柴油降解率范圍為（70.49±2.50）%～（78.76±1.24）%。對這4株菌進行3菌和4菌的等比例的隨機組合，構建混合菌群，從而篩選得到最佳柴油降解復合酵母菌S1-5（C2+D1+D3），降解率達到（85.30±1.29）%。

采用形態學觀察、生理生化特征分析及16S rDNA、26S rDNA測序等方法對C2、D1、D3進行鑒定，鑒定表明酵母菌C2、D3為解脂耶羅維亞酵母，D1在形態上與兩者略有不同，以單菌株與GenBank上的相似序列比對分析，發現其屬于解脂耶羅維亞酵母，但3株菌共同比對時，發現D1與C2及D3親緣關系上有一定距離。所以復合菌S1-5中C2和D3為同一種菌，D1為關系非常接近的菌株，3者組合在一起后，降解柴油的效率明顯提高，這就說明在選育混合菌時不僅可以構建不同菌種的混合模式，也可以構建同種不同菌株的混合模式。

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