菌株混合培養的溶磷解鉀效果及條件優化

摘要：將溶磷菌、固氮菌和解鉀菌按功能不同兩兩組合培養后篩選出互相不拮抗的菌株組合，進行三菌混合培養，測試得到的5組混合菌株的溶磷、解鉀能力。結果表明，混合培養菌的溶磷、解鉀能力均比各菌單獨培養時要高，其中，組合1、2和5混合培養時具有1+1+1>3的溶磷效果，組合3和5混合培養時具有1+1+1>3的解鉀效果。探索組合5的最佳培養條件，發現當培養基C/N比為25，pH 9，溫度為30 ℃時菌株生長總量最好。

關鍵詞：溶磷菌；固氮菌；解鉀菌；混合培養；優化

中圖分類號：Q935 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）02-0323-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.02.013

微生物是土壤肥力的核心，土壤中的微生物不僅數量巨大，而且種類極多，許多微生物對土壤氮、磷和鉀等養分的轉化和供給起非常重要的作用[1]。氮、磷和鉀均是作物生長發育必須的大量元素。解磷菌能夠將植物難以吸收利用的磷轉化為可溶狀態，供植物吸收利用[2]；根瘤菌能夠固定空氣中的分子態氮形成氨，為植物提供氮素營養；硅酸鹽細菌（又名鉀細菌）能夠分解土壤中的固定態鉀轉化為作物可以直接吸收利用的有效鉀[3，4]。同時根瘤菌、溶磷菌和硅酸鹽細菌可分泌促生長活性物質促進植物的生長，因此是理想的生物肥料菌種。

早在20世紀就有學者發現不同菌株組合混合培養可以形成不同的產物[5]。研究認為混合培養能減少或避免純培養過程中生物活性的下降，增加培養菌生物量，可以獲得更多的菌株性質[6]。陶光燦等[7]研究了細菌組合的固氮、解磷與不同培養條件以及混合培養，研究結果表明，微生物之間存在著協同作用。如柄桿菌（Caulobacter）與藍細菌（Cyanobacteria）混合培養時，提高了藍細菌生物量的同時，促進其色素的合成和積累，提高乙炔還原活力[8]。說明各菌之間可能直接或間接地相互作用，互相提供所需的營養，轉移或消除抑制產物，或通過一些物理或生化機制刺激彼此間的生理活動[9]。

本研究通過對實驗室保存的2株固氮菌、1株解鉀菌和2株溶磷菌以及本試驗自行篩選得到的一株溶磷菌P0417進行單獨培養和混合培養，研究菌株之間的互作效應，為符合微生物肥料的開發利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

供試菌株為桂花樹下根際黏附的土壤篩選得到的一株溶磷菌P0417，從普通微生物保藏中心購買的2株溶磷菌，2株固氮菌和1株解鉀菌（表1）。

1.2 菌株間拮抗反應

分別將活化后的3種功能菌菌株兩兩混合接種在LB平板培養基上，將一株菌的菌懸液平鋪在平板培養基上，另一株菌直接從斜面挑出點在平板上，28 ℃培養2～3 d，每天觀察交叉點處細菌生長狀況，若交叉點處產生了透明圈，則說明兩菌株間有拮抗作用，不適合混合培養；若交叉點處未產生透明圈，且生長良好，則說明兩菌株不發生拮抗作用，可以混合培養。

1.3 菌株溶磷和解鉀作用

1.3.1 培養基 PKO培養基（解磷培養基）配方如下：Ca3（PO4）2 10 g[Ca3（PO4）2單獨滅菌后加入]，葡萄糖10 g，MgSO4·7H2O 0.3 g， NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g， FeSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4 ·4H2O 0.03 g，（NH4）2SO4 0.5 g，pH 7.0～7.2，去離子水1 000 mL。

硅酸鹽細菌培養基（解鉀培養基）配方如下：蔗糖 5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，FeCl3 0.005 g，CaCO3 0.1 g，Na2HPO4 2 g，鉀長石粉 2 g，去離子水1 000 mL。

液體培養基配方如下：葡萄糖（按試驗需求比例確定用量）；NH4SO4 0.2 g；NaH2PO4 0.05 g；K2HPO4 1.31 g； MgSO4·7H2O 0.5 g； CaCl2 0.01 g；去離子水1 000 mL。

1.3.2 菌株溶磷量的測定 采用鉬藍比色法測定上清液有效磷含量，同時根據磷標準曲線計算溶磷量。

1.3.3 菌株解鉀量的測定 鉀標準曲線的繪制：稱取0.190 7 g氯化鉀標準品經110 ℃烘干2 h，用去離子水定容至1 L，此溶液含K 0.1 mg/mL，分別吸取該溶液0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL定容至100 mL容量瓶中，相應的標準溶液濃度為0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 μg/mL的氯化鉀。采用原子吸收法測定鉀離子量，以鉀濃度為橫坐標，原子吸收光度為縱坐標，繪制標準曲線。

樣品處理：將6株菌分別接種至硅酸鹽細菌培養基中培養5 d，取發酵液至旋轉蒸發儀蒸餾濃縮到10 mL左右，加入6% H2O2少許，繼續蒸餾，反復處理，直至硅酸鹽細菌黏液消失為止，加水過濾至100 mL容量瓶定容，采用原子吸收法測定鉀離子量[10]。

1.4 最佳菌株組合混合培養條件的優化

綜合菌株混合培養的溶磷和解鉀效果，選出一組效果最佳的混菌組合進行培養條件的優化，獲得菌體生長最佳的培養條件，以紫外分光度計在OD660 nm下測定菌懸液濃度作為指標。

1.4.1 單因素試驗 對培養條件的3個因素C/N比、pH和溫度進行單因素條件優化。菌株在LB斜面活化24 h后，按1%接種量接種于各相對應條件培養基中培養，每組3次重復，搖床培養2 d后，以不接菌為空白對照組用紫外分光度計在OD660 nm下測定菌懸液濃度。

1.4.2 正交試驗優化 單因素優化后設計了C/N比（20、35、30），pH（7、8、9），溫度（28、30、35 ℃）的3因素3水平的正交試驗對培養條件進行優化。選用L9（33）正交組合進行試驗，因素水平如表1所示。

2 結果與分析

2.1 菌株間拮抗反應

3種功能菌兩兩組合培養（共計11個處理），結果發現菌株1.1870和菌株1.2327混合培養后平板中產生了透明圈（圖1），其中左圖為將菌株1.1870涂布于平板，菌株1.2327以圓點形式點在平板上產生拮抗反應，右圖反之。這說明這兩種菌株之間產生了拮抗反應，不能進行混合培養，而其他菌株混合培養后未出現透明圈，說明菌株之間不會產生拮抗反應，可以進行混合培養。

2.2 菌株單獨溶磷磷解鉀作用

6株菌的溶磷、解鉀量如表2所示，由表2可見，菌株1.867溶磷量最高，為952.04 μg/mL，菌株1.2411的解鉀量最高，為2.85 μg/mL。

2.3 菌株混合培養溶磷解鉀作用

2.3.1 菌株組合處理 在3株溶磷菌，2株固氮菌，1株解鉀菌中，任意挑選每種功能菌各一株進行三菌株組合培養，去除產生拮抗作用的菌株組合，得到如下5組三菌株組合菌：①P0417+1.2327+1.2411；②P0417+1.2391+1.2411；③1.867+1.2391+1.2411；④1.867+1.2327+1.2411；⑤1.1870+1.2391+1.2411。

2.3.2 組合菌的溶磷解鉀效果 將上述5組組合菌分別進行混合培養后，其溶磷解鉀效果如表3和表4所示。組合1、組合2和組合5混合培養后其溶磷量實際值分別比理論值高117.35、592.86和851.31 μg/mL，說明這3組組合混合培養后的溶磷量達到1+1+1>3的效果，其中，組合2和組合5的溶磷效果更佳。而組合3和組合4的實際溶磷量小于理論值，溶磷效果不佳。解鉀效果上，5種組合的解鉀量均達到1+1+1>3，其中組合3的差值為2.11 μg/mL，組合5的差值為2.38 μg/ml，這兩組組合的解鉀效果更佳。綜合溶磷和解鉀效果，最終確定組合5即菌株1.1870、1.2391和1.2411混合培養時溶磷解鉀的效果最好。

2.4 最佳菌株組合混合培養條件的優化

分別選用C/N比20、25、30、35和40作為組合5混菌培養時的培養基組成，培養2 d后發現C/N比為25時菌株混合生長狀況最佳（圖2）。選用pH 5、6、7、8和9的培養基分別進行培養后，發現pH 8條件下菌株生長最好（圖3）。選用溫度為25、28、30、35和37 ℃為其生長溫度進行培養后，發現30 ℃時菌株生長最好（圖4）。

正交試驗優化組合5培養條件分析結果如表5所示，方差分析結果如表6所示。綜合正交試驗結果（表5）的K值和極差R大小與方差分析（表6）可知，影響3株菌株混合生長量的順序為C>B>A，即溫度>pH>C/N比，因此溫度是影響菌株生長量的主要原因，其次是pH，最后是C/N比。菌株的理論最優培養條件為A2B3C3，即C/N比為25，pH 9，溫度為30 ℃。因此，在該優化培養條件下進行了補充試驗，接種活化第2代3株供試菌株，同條件下培養后生長量OD600 nm為1.109，比原優化前培養液生長量高，因此調整后的培養條件更有利于3株菌株混合共同培養。

3 小結與討論

在自然界中微生物是以混居狀態存在的，對于它們之間相互關系的了解有助于人類有意識地充分發揮其互作效應[11]。微生物之間存在著協同、競爭、拮抗、捕食等作用，探討其具體關系有助于進一步開發微生物單一菌劑及復合菌劑[12]。目前中國微生物肥料發展迅速，所用的菌種主要是解磷菌、解鉀菌和固氮菌，謝應先[13]報道這3種細菌都是土壤習居菌，相互之間沒有抑制作用或只有微弱的抑制作用，解磷菌還能促進其他細菌生長繁殖。目前已有研究結果表明，這3種菌株間混合培養可以顯著提高微生物的生物量和生理代謝功能[14]。如已有報道硅酸鹽細菌具有提高土壤中速效鉀、磷含量，及作物產量和品質等作用[15-17]，但目前國內在這方面的研究較少[18]。

本試驗將實驗室所保存的2株溶磷菌、2株固氮菌和1株解鉀菌以及實驗室前期篩選得到的1株溶磷菌共6株細菌分別進行單菌株培養和混合培養，發現每一株菌溶磷解鉀能力存在一定差異。單菌發酵時發現圓褐固氮芽孢桿菌1.2391沒有溶磷能力，豌豆根瘤菌1.2327有少許溶磷能力，菌株P0417和熒光假單胞菌1.867的溶磷能力較強，環狀芽孢桿菌1.2411和巨大芽孢桿菌1.1870的解鉀效果較好。通過拮抗試驗得出5組組合菌，將每組在同條件下培養發酵，結果表明，混合培養發酵液的溶磷、解鉀能力與單個菌株相比有大幅度提高，其中組合2和組合5中表現出強大的溶磷促進作用，此組合體現出1+1+1>3的溶磷效果，而組合3和組合4則未體現出1+1+1>3的溶磷效果，這可能是由于營養及空間上的限制，導致互相之間產生一定的抑制作用。在解鉀能力上，組合3和組合5表現出較強的解鉀促進作用，其他3組也有一定程度的促進作用。通過溶磷和解鉀的雙重作用比較，選擇組合5為菌株最佳組合。進一步探索組合5混合培養最佳發酵條件，得出當培養基C/N比為25，pH 9，溫度為30 ℃時菌株生長量最好，這為新型微生物菌肥的研制和開發奠定了理論和物質基礎。

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