兩株石油降解菌的篩選及其生長特性

摘要：以原油為惟一碳源，通過富集馴化的培養(yǎng)方法，從新疆石油污染土壤中分離到2株石油降解菌，分別命名為XD-1和XD-2。根據(jù)其形態(tài)和生理生化特征分析，初步鑒定XD-1屬于芽孢桿菌屬（Bacillus sp.），XD-2屬于假單孢菌屬（Pseudomonas sp.）。采用單因素試驗考察環(huán)境因素對菌株生長的影響，結(jié)果表明，菌株XD-1和XD-2可生長的pH范圍為6.0～9.0，最適生長pH為7.5；可生長的溫度范圍為15～45 ℃，最適生長溫度為30 ℃；菌株XD-1有較高的耐鹽能力，NaCl濃度生長范圍是0～70.0 g/L，2株菌的最適生長鹽度為5.0 g/L。在此環(huán)境條件下，通過7 d 液體降解試驗，菌株XD-1、XD-2 對1 000 mg/L石油降解率分別達到62.14%和63.66%。該研究為石油污染物的生物降解與污染土壤的生物修復(fù)提供了依據(jù)。

關(guān)鍵詞：石油污染；石油降解菌；篩選；培養(yǎng)條件

中圖分類號：X172 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）02-0333-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.02.016

土壤是人類賴以生存的自然基礎(chǔ)和重要資源，近年來，隨著社會經(jīng)濟發(fā)展對石油產(chǎn)品需求量增加，大量的石油及其加工品在勘探、開采、運輸、加工及儲存的過程中進入土壤，造成土壤的石油污染日趨嚴重，已成為世界性的環(huán)境問題[1，2]。石油物理化學性質(zhì)特殊，進入土壤后殘留時間長，在自然條件下難以降解，給受污染土壤帶來一系列的危害：石油黏性強，影響土壤的通透性，使土壤鹽堿化、瀝青化和板結(jié)化，破壞土壤結(jié)構(gòu)和功能，在長期累積過程還會導(dǎo)致土壤中碳氮比和碳磷比失調(diào)，引起土壤微生物群落變化，破壞土壤微生物區(qū)系，影響植物生長；石油中所含的多環(huán)芳烴具有致癌、致突變、致畸變等作用，它們能通過食物鏈在動植物體內(nèi)逐級富集，危及人類健康和生態(tài)安全[3，4]。鑒于以上原因，修復(fù)和治理污染土壤已經(jīng)成為迫切需要研究解決的問題。

目前石油污染土壤的修復(fù)方法主要有物理方法、化學方法和生物方法，其中微生物處理技術(shù)具有經(jīng)濟、有效和環(huán)境友好等特點，是目前修復(fù)石油污染土壤優(yōu)先考慮的技術(shù)[5，6]。微生物修復(fù)技術(shù)是微生物通過代謝作用將石油污染物轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定、無毒的以二氧化碳、水和無機物為主的降解產(chǎn)物。石油的降解程度和速度取決于微生物特性、污染物的性質(zhì)和環(huán)境因素，而具有強降解能力的石油降解菌是決定生物修復(fù)效率的關(guān)鍵因素。因此，需要有針對性地篩選適合本地區(qū)石油污染土壤的土著高效降解菌。新疆是中國石油主產(chǎn)區(qū)，存在大面積石油污染土壤亟待修復(fù)[7，8]。基于此，本研究從新疆石油污染土壤中篩選出2株高效石油降解菌，通過形態(tài)和生理生化試驗對其進行了初步鑒定，并初步研究該菌的生長特性和培養(yǎng)條件，以期為新疆石油污染土壤的微生物修復(fù)提供試驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土壤和石油樣品 分離菌種土壤采自新疆油田區(qū)污染程度不同的位置，采樣時取地表10 cm污染土壤1.0 kg，去除雜物，裝入密封袋，于4 ℃冰箱保存。原油取自克拉瑪依油田采油廠。

1.1.2 培養(yǎng)基

1）分離篩選培養(yǎng)基：

無機鹽培養(yǎng)基：K2HPO4·3H2O 1.00 g/L，KH2PO4 1.00 g/L，MgSO4·7H2O 0.50 g/L，NH4NO3 1.00 g/L，CaCl2 0.02 g/L，F(xiàn)eCl3痕量，pH 7.5。

油平板：無機鹽培養(yǎng)基1 L，原油2 mL，瓊脂20 g。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.00 g/L，酵母提取物 5.00 g/L，NaCl 10.00 g/L，瓊脂 18.00 g/L，pH 7.0。

2）發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖20.00 g/L，蛋白胨5.00 g/L，酵母提取物3.00 g/L，NaCl 5.00 g/L，pH 7.5。

3）降解培養(yǎng)基：無機鹽培養(yǎng)基，原油1.00 g/L，pH 7.5。

4）生理生化鑒定培養(yǎng)基[9]：葡萄糖氧化培養(yǎng)基、淀粉水解培養(yǎng)基、硝酸鹽還原培養(yǎng)基、吲哚培養(yǎng)基、M.R.培養(yǎng)基、V.P.培養(yǎng)基、檸檬酸鹽培養(yǎng)基、明膠水解培養(yǎng)基等。

1.2 方法

1.2.1 石油降解菌的富集、分離和純化 稱取10 g土樣加入到含石油（1 000 mg/L）的100 mL無機鹽培養(yǎng)基中，于30 ℃、150 r/min進行富集培養(yǎng)，每隔5 d取培養(yǎng)液以10%的轉(zhuǎn)接量依次轉(zhuǎn)入新鮮無機鹽培養(yǎng)基中，并逐步提高石油濃度到1 500、2 000、 2 500、3 000 mg/L。通過觀察石油層消失與否判斷石油的降解程度，連續(xù)馴化傳代5次后，取100 μL富集液涂布于油平板上，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。挑取單菌落，連續(xù)劃線純培養(yǎng)3次，得到純化菌株2株，分別命名為XD-1、XD-2。用 LB 培養(yǎng)基（添加1 000 mg/L石油）于30 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)24 h 后，用30%甘油保存菌種（-70 ℃保藏），作為備用菌株。

1.2.2 菌株形態(tài)、生理生化鑒定方法 將所篩選菌株接種于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基，在30 ℃下培養(yǎng)24 h，觀察菌落外部形態(tài)特征，生理生化測定包括菌株XD-1、XD-2革蘭氏染色、芽孢染色、糖發(fā)酵試驗、淀粉水解試驗、硝酸鹽還原試驗、M.R.試驗、V.P.試驗、吲哚試驗、明膠液化試驗、檸檬酸鹽利用試驗、氧化酶和過氧化氫酶測定，操作方法見文獻[9]。

1.2.3 石油降解菌生長曲線和生長特性研究 將菌株XD-1、XD-2分別接入發(fā)酵培養(yǎng)基中活化，于30 ℃，150 r/min振蕩培養(yǎng)12 h后，將1%的菌懸液轉(zhuǎn)入盛有100 mL新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以不加菌為對照，每隔2 h取樣，測定不同培養(yǎng)時間的菌液OD600 nm，繪制菌株DM-1的生長曲線。

耐溫性：各取一環(huán)菌種接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別于15～45 ℃下培養(yǎng)48 h后于600 nm處測定發(fā)酵液的OD600 nm，以確定菌株生長的最適生長溫度。

耐酸性：各取一環(huán)菌種接入pH為5～10的發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)48 h后于600 nm處測定發(fā)酵液的OD600 nm，以確定菌株生長的最適生長pH。

耐鹽性：各取一環(huán)菌種接入NaCl含量為0～70.0 g/L的發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)48 h后于600 nm處測定發(fā)酵液的OD600 nm，以確定菌株最適生長鹽濃度。

1.2.4 石油降解率的測定 將純化菌株XD-1、XD-2接入發(fā)酵培養(yǎng)基，于30 ℃、150 r/min培養(yǎng)24 h，離心去上清液，用滅菌水洗滌后重懸、離心，連續(xù)洗滌2次，制成種子液（1×107 CFU/mL），吸取5 mL上述種子液接入降解培養(yǎng)基中，于30 ℃、150 r/min連續(xù)培養(yǎng)7 d，以重量法測定殘油量。將降解后的液體酸化（pH<2），全部轉(zhuǎn)移至150 mL分液漏斗中，加入4 g NaCl，用石油醚洗滌降解瓶，并轉(zhuǎn)入分液漏斗中，充分振搖3 min，靜置分層，石油醚層轉(zhuǎn)入新錐形瓶中，用石油醚重復(fù)萃取水樣2次，合并3次萃取液于錐形瓶；向石油醚萃取液中加入適量無水硫酸鈉（至不再結(jié)塊為止），密封后放置0.5 h脫水；用預(yù)先以石油醚洗滌過的定性濾紙過濾，收集濾液于50 mL已烘干至恒重的燒杯中，用少量石油醚洗滌錐形瓶、硫酸鈉和濾紙，洗滌液并入燒杯中將燒杯置于65 ℃恒溫箱中，蒸出石油醚，在干燥器中冷卻至恒重，稱量[10]。以不接菌的降解液體培養(yǎng)基作為對照，每個處理重復(fù)3次。

石油降解率的計算公式：

降解率=（m1-m2）/m1×100% （1）

式中，m1為對照樣品中石油烴含量（mg/L），m2為菌株降解后液體中石油烴含量（mg/L）。

2 結(jié)果與分析

2.1 石油降解菌的篩選及鑒定

2.1.1 石油降解菌的篩選 經(jīng)富集培養(yǎng)、分離純化，從新疆石油污染土壤中得到能以石油為惟一碳源生長的降解菌2株，分別命名為XD-1、XD-2。通過液體降解試驗初步研究了XD-1和XD-2降解石油的能力。結(jié)果表明，XD-1和XD-2在降解培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d，石油降解率分別達到了62.14%和63.66%，高于吳濤等[11]和王海峰等[12]篩選的菌株BF40和CZ-1對勝利油田原油的降解率。

2.1.2 石油降解菌的鑒定 菌株XD-1和XD-2在牛肉膏蛋白胨平板上生長良好，30 ℃培養(yǎng)24 h，XD-1菌落呈乳白色，粗糙有褶皺，不透明，表面較干燥，革蘭氏染色陽性，細胞桿狀，有芽孢，無莢膜，有鞭毛，能運動；XD-2菌落為黃綠色圓形，半透明，濕潤，革蘭氏陰性桿菌，無芽孢，無莢膜，單生鞭毛，能運動，2株菌株主要生理生化特性見表1。從菌株形態(tài)特征和生理生化特性初步將XD-1和XD-2鑒定為芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）和假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）。

2.2 石油降解菌生長特性研究

2.2.1 石油降解菌生長曲線的測定 微生物有4個生長時期，菌種特性決定各時期的長短，在發(fā)酵和降解試驗中往往要求縮短菌種的延滯期，使其快速進入對數(shù)生長期，由于處于這一時期的菌種生長代謝活躍，抗沖擊性強，接種后能迅速生長，有利于縮短發(fā)酵周期，因此，需要明確石油降解菌XD-1和XD-2的生長曲線（圖1）。從菌株的生長曲線可以看出，XD-1和XD-2都是培養(yǎng)6 h后進入對數(shù)生長期，到24 h左右達到對數(shù)生長后期。因此，后續(xù)試驗選取培養(yǎng)24 h的菌液作為種子液。

2.2.2 初始pH對石油降解菌生長的影響 為確定篩選菌株XD-1和XD-2的最佳生長條件，試驗研究了酸度、溫度和鹽度對菌株生長的影響。利用HCl和NaOH溶液調(diào)節(jié)種子培養(yǎng)基初始pH，30 ℃發(fā)酵48 h，考察初始pH對2株石油降解菌生長的影響，結(jié)果見圖2。

由圖2可知，初始pH對2株菌生長的影響相似，適應(yīng)于微堿性的環(huán)境。隨著pH升高，菌株XD-1和XD-2的數(shù)量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，pH 6.0～8.0時生長良好，最適生長pH為7.5；pH為5.0和9.0時，生長受到明顯抑制，而pH 10.0時不能生長。

2.2.3 溫度對石油降解菌生長的影響 在發(fā)酵培養(yǎng)基中，選擇細菌常規(guī)生長溫度研究培養(yǎng)溫度對2株石油降解菌生長的影響，結(jié)果見圖3。從圖3可以看出，隨發(fā)酵溫度升高，菌株XD-1和XD-2的數(shù)量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，30 ℃為最適生長溫度；可生長的溫度范圍為15～45 ℃，溫度低于25 ℃和高于35 ℃時，菌株的生長會受到抑制，可能是由于溫度下降會造成菌株細胞內(nèi)酶活降低，新陳代謝活動減慢。

2.2.4 鹽濃度對石油降解菌生長的影響 利用NaCl調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基的鹽度，在pH 7.5、30 ℃條件下發(fā)酵48 h，考察鹽濃度對2株石油降解菌生長的影響，結(jié)果見圖4。從圖4可以看出，隨著發(fā)酵液中NaCl濃度增加，菌株XD-1和XD-2的數(shù)量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，2株菌在NaCl濃度為5.0 g/L時生長最好；菌株XD-1有較高的耐鹽能力，可以在NaCl濃度為70.0 g/L培養(yǎng)液中生長，屬于中度耐鹽菌，而菌株XD-2只能耐受50.0 g/L的含鹽量。綜合發(fā)酵試驗結(jié)果，石油降解菌XD-1和XD-2的最佳培養(yǎng)條件為溫度30 ℃、pH 7.5、NaCl濃度5.0 g/L。

3 結(jié)論

從石油污染土壤中篩選分離到2株優(yōu)勢石油降解菌，經(jīng)形態(tài)和生理生化初步鑒定，XD-1為芽孢桿菌屬細菌（Bacillus sp.），XD-2為假單胞菌屬細菌（Pseudomonas sp.），2株菌對1 000 mg/L石油的降解率分別達到了62.14%和63.66%，具有較好的應(yīng)用潛力和前景。從生長曲線分析，菌株XD-1和XD-2適宜菌齡為24 h，適應(yīng)于微堿性環(huán)境中生長，可生長的pH范圍為6.0～9.0，最適生長pH為7.5；可生長溫度范圍為15～45 ℃，最適生長溫度為30 ℃，菌株XD-1有較高的耐鹽能力，可以在NaCl濃度為70.0 g/L發(fā)酵液中生長，屬于中度耐鹽菌，菌株XD-1和XD-2最適生長鹽濃度為5.0 g/L。

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